pcr技術(shù)的種類及應(yīng)用資料-全文預(yù)覽
【正文】 速擴(kuò)增，可在短時(shí)間內(nèi)從試管中獲得數(shù)百萬(wàn)個(gè)特異DNA序列拷貝。PCR技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用平駿 14112822276摘要：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）是1985年由美國(guó)PE Cetus 公司的科學(xué)家Kary Banks Mullis發(fā)明的一種可在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的技術(shù)。關(guān)鍵詞：PCR技術(shù)；PCR原理；PCR新技術(shù)對(duì)核酸的研究己有100多年的歷史，20世紀(jì)70年代初人們就致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想，該設(shè)想在1985年被Mullis等人實(shí)現(xiàn)，他們發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)[6]。 PCR 技術(shù)的原理[1,2]PCR技術(shù)是模擬細(xì)胞內(nèi)DNA的天然復(fù)制過(guò)程，DNA 聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈 DNA 來(lái)啟動(dòng)合成，通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA 模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合，形成部分雙鏈。每一循環(huán)中所合成的新鏈，又都可作為下一循環(huán)中的模板。由于PCR反應(yīng)的特異性由寡聚核苷酸引物決定, 模板DNA不需要高度純化，但應(yīng)避免任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、能結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)及多糖類物質(zhì)的污染[18]。PCR 反應(yīng)成功的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)最佳的引物。在合成新鏈時(shí)，DNA聚合酶將單核苷酸添加到引物的3，末端，因此引物3，端的5 6 個(gè)堿基與靶 DNA 片段的配對(duì)必須精確、嚴(yán)格。該片段具有DNA聚合酶活性和3，5，的外切核酸酶活性，能識(shí)別和消除錯(cuò)配的引物末端，以校正復(fù)制過(guò)程中錯(cuò)配的核苷酸。目前，Taq DNA 聚合酶在PCR反應(yīng)中廣為應(yīng)用。mol/L為宜，但是也不能低于10 15181。 M g2+緩沖液PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液通常含有10mmol/L Tris HCl ()，50mmol/L 。同時(shí)，Mg2+的有效濃度受到高濃度的螯合劑、高濃度的帶負(fù)電荷離子基團(tuán)的影響，比如EDT A、磷酸根等。PCR相關(guān)技術(shù)的發(fā)展 PCR芯片傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增儀的缺點(diǎn)是體積大，因此所需的樣品量大，熱容量也大，降低了反應(yīng)效率。芯片表面的化學(xué)材料的特性對(duì)PCR的成功起到關(guān)鍵的作用。PCR芯片實(shí)質(zhì)上就是在固相載體上固定與研究對(duì)象相關(guān)的許多已知基因的引物陣列，并且用于PCR檢測(cè)，其制作時(shí)最關(guān)鍵的是目的基因的引物設(shè)計(jì)[17]。 固相PCR 所謂固相PCR，就是將特定引物寡核苷酸通過(guò)不同的方法共價(jià)固定到固相支持物上來(lái)擴(kuò)增目標(biāo)DNA。例如用瓊脂糖小珠固定引物與RTPCR相結(jié)合, 就能很方便地構(gòu)建cDNA文庫(kù)[12]。它的原理與BLAST相似，但是BLAST是將所查詢序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中序列的全長(zhǎng)進(jìn)行比對(duì)，而電子PCR是將所查詢序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中STS序列兩端的PCR引物序列進(jìn)行比對(duì)。當(dāng)待研究的基因序列不明，僅僅知其一部分蛋白質(zhì)的氨基酸序列，可根據(jù)已知氨基酸序列合成一組簡(jiǎn)并引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)基因家族中的未知基因進(jìn)行分離[15]。因?yàn)樘禺愐镌谝环N基因型中有擴(kuò)增產(chǎn)物，而在另一種基因型中沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠電泳可以很容易地分辨出是否有擴(kuò)增產(chǎn)物，從而確定基因型的SNP。ISPCR技術(shù)成功0地將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來(lái)，既可以定位靶序列在細(xì)胞或組織中的位置，又可以快速、靈敏、特異性的檢測(cè)樣品。原有的細(xì)胞內(nèi)單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，利用原位雜交技術(shù)可以很容易的檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物[6]。圖4 反轉(zhuǎn)錄PCR原理 (摘自 鄧小紅等, 2007) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR( realtime flurescent quantitive polymerase chain reaction, FQ PCR) 技術(shù)于1996年由美國(guó) Applied Biosystes公司推出[23]， FQ PCR是基于熒光能量傳遞技術(shù)，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整PCR進(jìn)程，受體熒光染料發(fā)射出的熒光信號(hào)強(qiáng)度與 DNA產(chǎn)量成正比，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法[23,7,3]。探針?lè)ㄓ挚煞譃樗馓结樂(lè)ǎ═aq Man探針）、分子信標(biāo)、雙雜交探針和復(fù)合探針?lè)?。使Taq DNA聚合酶只在樣品溫度超過(guò)至少70℃時(shí)才發(fā)揮
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