核酸提取及常見(jiàn)問(wèn)題分析-全文預(yù)覽
【正文】 引物在不含鹽及緩沖液條件下變性 /退火，提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度 反轉(zhuǎn)錄成功， PCR失敗 PCR步驟中使用超過(guò) 1/5的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物 可能原因 解決方案 RT常見(jiàn)問(wèn)題分析和解決方案 問(wèn)題二： 有非特異性帶 ? 引物和模板的非特異性退火 ? 基因特異性引物設(shè)計(jì)較差 ? RNA中有基因組 DNA的污染 ? 形成引物二聚體 ? 鎂離子濃度太高 提高反應(yīng)的溫度和特異性 提高引物的特異性 使用擴(kuò)增級(jí) DNaseⅠ 處理 RNA 設(shè)計(jì)在 339。 電泳帶型異常 ? 非變性電泳： ? 上樣量超過(guò) 3ug，電壓超過(guò) 6V/cm，電泳緩沖液陳舊，均可能導(dǎo)致 28S 和 18S 條帶分不開(kāi)。 ? 設(shè)備限制： ? 測(cè)定 OD260 及 OD280 數(shù)值時(shí) ， 要使 OD260 讀數(shù)在 之間 。 ? 苯酚殘留： ? 不要吸入中間層及有機(jī)相 ， 加入氯仿后首先混勻 ， 并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠 。 RNA降解 ? 冷凍樣品： ? 樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍 ， 然后可以移至70℃ 冰箱保存 ?？梢韵葘⒉牧腺A存在 TRIzol或樣品貯存液中，于－ 70℃ 或－ 20℃ 保存 ? 如要多次提取，請(qǐng)分成多份保存 ? 液氮長(zhǎng)期保存，－ 70℃ 短期保存 提取的因素影響 RNA提取的因素 ? 樣品破碎及裂解 ： ? 根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法： ? 培養(yǎng)細(xì)胞： 通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀? ? 酵母和細(xì)菌： 一般 TRIzol可直接裂解，對(duì)于一些特殊的材料可先用酶或者機(jī)械方法破壁 ? 動(dòng)植物組織： 先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。 ? 沉淀： 異丙醇、無(wú)水乙醇。 使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放 RNA，有效抑制核酸酶。 對(duì) 策 原因 1. 實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少 2. 破壁或裂解不充分 3. 沉淀不完全 4. 洗滌時(shí) DNA丟失 1. 盡量選用新鮮（幼嫩）的材料 2. 動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分； G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁 3. 高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加 PK的用量） 4. 低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間 5. 加輔助物，促進(jìn)沉淀 6. 洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒 DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題 ?問(wèn)題三： DNA提取量少。 ? 在提取緩沖液中加一定量的氯苯 (1/2體積 )，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。 ? 將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。 磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。 組份 TrisHCl （ ） EDTA （ pH ） NaCl SDS 終濃度 10 mM 20 mM 2% ? SDS法 DNA提取緩沖液 ? SDS法流程圖 （以動(dòng)物組織為例） 動(dòng)物組織 細(xì)胞裂解 上層溶液 組織勻漿 抽提 干燥溶解 離心洗滌 酒精沉淀 DNA溶液 基因組 DNA－ SDS法 基因組 DNA－其它方法 ? 物理方式 ：玻璃珠法、 超聲波法、研磨法、凍融法 ? 化學(xué)方式 ：異硫氰酸胍法、堿裂解法 ? 生物方式 ：酶法 ? 根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有： 基因組 DNA－其它方法 ? 吸附材料結(jié)合法： ? 根據(jù)核酸分離純化方式的不同有： ? 硅質(zhì)材料 ? 陰離子交換樹(shù)脂 ? 磁珠 高鹽低 pH值結(jié)合核酸，低鹽高 pH值洗脫。 ? 該復(fù)合物在高鹽溶液中（ ）是可溶的，通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。 前言 第一部分： DNA提取方法簡(jiǎn)介 第二部分： DNA提取常見(jiàn)
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