最權(quán)威最齊全的pcr匯總及其原理-程序-全文預(yù)覽
【正文】 結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。為了克服此缺點(diǎn)，可彩用同一反應(yīng)管中巢式PCR，主要利用內(nèi)外引物Tm值不同。在RACE(rapidamplification由于第二套引物位于第一輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部，而非目的片斷包含兩套引物結(jié)合位點(diǎn)的可能性極小，因此第二套引物不可能擴(kuò)增非目的片斷。第一對(duì)引物也可能結(jié)合到其他具有相似結(jié)合位點(diǎn)的片段上并擴(kuò)增多種產(chǎn)物。第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異。 巢式PCR巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對(duì)（而非一對(duì)）PCR引物擴(kuò)增完整的片段。 4． PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。 2． 為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照。 ?。?） 電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。輕輕混勻，離心。 ?。?）于70℃加熱15min以終止反應(yīng)。 ?。?）70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。 2. cDNA第一鏈的合成（Reverse Transcription）：目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。由于Poly(A )RNA僅占總RNA的14%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。用此種方法時(shí)，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴(kuò)增過程中賦予所需要的特異性。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2 存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA，以消除RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 反轉(zhuǎn)錄PCR 一、反轉(zhuǎn)錄酶的選擇 1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性，RNA酶H活性相對(duì)較弱。RTPCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。先將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再以cDNA為模板，用PCR方法加以擴(kuò)增。反向PCR 反向PCR是一種新型的基因擴(kuò)增方法，它能擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對(duì)引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。較高的溫度有利于減少非特異的引物結(jié)合，因而提高特異產(chǎn)物的得率。 3. 基因特異性引物 與模板序列互補(bǔ)的引物，適用于目的序列已知的情況。主要用于單一模板的RTPCR反應(yīng)。 合成cDNA引物的選擇 用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。 反轉(zhuǎn)錄酶的選擇兩種方法Money 鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶 有較強(qiáng)的聚合酶活性，RNA酶H活性相對(duì)較弱。RTPCR 過程 RTPCR可以用一步法或兩步法的形式進(jìn)行。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。RTPCRTPCR RTPCR簡(jiǎn)介 反轉(zhuǎn)錄RTPCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。再以cDNA為模板經(jīng)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。在一步法RTPCR中，在同時(shí)為反轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，反轉(zhuǎn)錄和PCR在一直觀眾順次進(jìn)行。最適溫度為42176。適用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。）由于Olig
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