幾種pcr擴(kuò)增的比較-全文預(yù)覽
【正文】 選擇限制酶，或者說(shuō)必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的DNA片段。 反向PCR的目的在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說(shuō)這一反應(yīng)體系不是在一對(duì)引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱(chēng)為染色體緩移或染色體步移。因此，原位PCR技術(shù)成為重要的檢測(cè)手段。 感染病毒的細(xì)胞常無(wú)較好的檢測(cè)手段，但當(dāng)原位PCR技術(shù)應(yīng)用后，使這一極為困難的問(wèn)題有望解決。 原位檢測(cè):原位PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法，取決于原位PCR的設(shè)計(jì)方案，直接法則根據(jù)標(biāo)記分子的性質(zhì)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行原位檢測(cè)。 洗滌:原位擴(kuò)增結(jié)束后，標(biāo)本應(yīng)清洗，以除去彌散到細(xì)胞外的擴(kuò)增產(chǎn)物。 熱循環(huán):原位PCR的熱循環(huán)可在專(zhuān)門(mén)的熱循環(huán)儀上進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便。原位PCR宜用較短的引物。蛋白酶消化后，要注意加熱以滅活酶的活性或通過(guò)充分的洗滌將酶完全去除，因?yàn)橹灰猩倭康臍埩裘复嬖?，都將?duì)隨后進(jìn)行的PCR反應(yīng)體系的數(shù)量TaqDNA酶產(chǎn)生毀滅性的影響。 蛋白酶的消化作用:在進(jìn)行原位擴(kuò)增之前，組織標(biāo)本需經(jīng)蛋白酶處理。固定的時(shí)間一般不宜過(guò)長(zhǎng)，視組織的大小，一般以4℃46小時(shí)為宜。隨著技術(shù)方面的一些問(wèn)題被解決，近年也有從石蠟切片中得到滿(mǎn)意的PCR效率的報(bào)道。 3基本步驟原位PCR技術(shù)的基本步驟包括標(biāo)本的制備。 間接法PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是特異性較高，擴(kuò)增效率也較高。若用標(biāo)記引物的方法進(jìn)行直接法原位PCR，其擴(kuò)增的效率比不標(biāo)記更低。常用的標(biāo)記物有放射性同位素35S，生物素和地高辛，用放射性自顯影的方法或用親和組織化學(xué)及免疫組織化學(xué)的方法去顯示標(biāo)記物所在位置。這樣原有的細(xì)胞內(nèi)單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數(shù)極擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物就很容易被原位雜交技術(shù)檢查。 原位PCR技術(shù)成功地將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來(lái)，保持了兩項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)又彌補(bǔ)了各自的不足。這一技術(shù)的問(wèn)世，必將帶來(lái)更多的研究成果，使形態(tài)學(xué)的研究又向前邁出一大步。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線(xiàn)照射，以破壞存在的核酸。 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。 出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。 物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱(chēng)，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。⑤模板核酸變性不徹底?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。 每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。隨后PCR技術(shù)在生物科研和臨床應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用，成為分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)。他發(fā)表了第一個(gè)單純且短暫性基因復(fù)制（類(lèi)似PCR前兩個(gè)周期反應(yīng)）的實(shí)驗(yàn)。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年發(fā)現(xiàn)，而較具有實(shí)驗(yàn)價(jià)值及實(shí)用性的Klenow fragment of E. Coli 則是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性, 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復(fù)制。PCR最初的原始雛形概念是類(lèi)似基因修復(fù)復(fù)制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。此后，PCR的運(yùn)用一日千里，相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量可以說(shuō)是令眾多其它研究方法難望其項(xiàng)背。PCR由變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性退火延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。 （70℃75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。 其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。 靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=1012)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(μg=106)水平。不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板。 模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中
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