【正文】 osystemsStore（AppliedBiosystems產(chǎn)品倉庫）訂購所建議的材料。3）從單位下拉菜單中，選擇ng/181。L。（檢測預混液濃度）。5）確認ExcessReactionVolume（額外反應體積）字段中顯示10%。L。GeneExpressionAssays，則選擇Inventoried/MadetoOrder（庫存/定制）。2）從SelectTarget（選擇靶）窗格中，選擇RNaseP。查看反應設置在ReactionSetup（反應設置）屏幕上，選擇檢測類型（如果使用TaqMan試劑），然后查看為準備PCR反應、標準稀釋序列和樣本稀釋而計算的劑量。–如果正執(zhí)行一步法RTPCR擴增，則包括一個反轉(zhuǎn)錄步驟。StepOne系統(tǒng)支持10至30181。1）單擊選擇GraphicalView（圖形視圖）選項卡（默認）或TabularView（表格視圖）選項卡。（放置陰性對照）下拉菜單中，選擇UpperLeft（左上角）（默認）。6）選擇AllSample/TargetReactions（所有樣本/靶反應）以檢測所有樣本中的所有靶。4）：（輸入樣本名）字段，然后輸入pop1（用于重復組1）。（根據(jù)需要填）2）單擊Howmanyreplicatesdoyouneed?（您需要多少次重復反應？）字段，然后輸入3。標準曲線應包含如下點：10000、5000、2500、1250和625。序列倍數(shù)用于計算標準曲線所有點中的數(shù)量。由于標準品數(shù)量的范圍會影響擴增效率計算，因此應仔細為您的檢測考慮標準品數(shù)量的適當范圍：–為了更準確地測量擴增效率，請使用大范圍的標準品數(shù)量，擴大到5個至6個對數(shù)級之間。建議每條標準曲線應至少有五個稀釋點。4）Next（下一步）。Green染料以檢測雙鏈DNA，則選擇SYBR。–如果要將JOETM染料加在您用于檢測靶的TaqMan探針的5′端，則選擇JOE。注意：SetUpStandards（設置標準品）復選框默認情況下已選取。1）單擊Howmanytargetsdoyouwanttoquantifyinthereactionplate?（您想在反應板中定量多少靶？）字段，然后輸入1（根據(jù)需要填）。–如果為PCR反應使用標準試劑（包括SYBRGreen試劑和TaqMan試劑），則選擇Standard(~2HourstoCompleteaRun)（標準（約2小時完成運行））。將Standard（標準）選為升降溫速度。引物設計用于擴增靶。切記！AppliedBiosystems不建議將TAMRATM染料隨StepOneTM系統(tǒng)用作熒光報告基團或淬火基團。TaqMan試劑包括兩個引物和一個TaqMan174。2）為試劑選擇TaqMan174。?標準品稀釋序列－一組用于構(gòu)建標準曲線的標準品稀釋液（例如，1:1:1:1:11:32）。從已知量的稀釋序列中構(gòu)建的標準曲線用于歸檔結(jié)果。Materials（方法和材料）屏幕上，選擇用于實驗的定量方法、試劑、升降溫速度和PCR模板。2）Barcode（條碼），然后輸入您的PCR反應板上的條碼。然后，算法將搜索擴增曲線上基線校準后歸一化報告熒光信號強度（deltaRn[?Rn]值）與閾值交叉的點。擴增曲線以圖形形式顯示在執(zhí)行的循環(huán)次數(shù)中檢測到的熒光。二、試劑盒法提取大腸桿菌基因組DNA。將溶液定容到500ml后，高溫高壓滅菌，室溫保存）3）蛋白酶K：（20mg蛋白酶K溶于1ml無菌雙蒸水，20℃?zhèn)溆茫?）CTAB/NaCl溶液：（5%w/v，需加熱到65℃使之溶解，然后室溫保存）實驗方法步驟將大腸桿菌接種到滅菌好的LB培養(yǎng)基中，一級培養(yǎng)過夜，以10%的接種量進行二級培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)期（46h）。CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）是一種去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中（）是可溶的，當降低溶液鹽濃度到一定的程度（）時，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB核酸的復合物與蛋白，多糖物質(zhì)分開。SDS的作用機理是由于其能結(jié)合蛋白，中和蛋白的電性，使蛋白質(zhì)的非共價鍵受到破壞，失去二級結(jié)構(gòu)，從而變形失活，蛋白酶K或鏈霉蛋白酶E均為光譜蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在的情況下保持很高的活性。實驗原理提取DNA的一般過程是將分散好的組織細胞在含十二烷基硫酸鈉（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。為獲得高純度DNA，操作過程中常加入RNaseA除去RNA。(攪拌溶解后，用5mol/，用20/50ml搖瓶分裝5瓶，包扎好，在121℃，105pa高壓下蒸汽滅菌20min.)2）TE緩沖液：1MTris溶液（，加ddH2O至1600ml，加熱溶解）（取1MTris溶液160ml用分析純鹽酸調(diào)至Ph=（），加ddH2O定容至200ml，高壓滅菌備用）TE緩沖液（10mMTrisHCl1MmEDTApH=，1MTrisHClBufferPH==。加30ulCTAB/NaCl溶液，混勻，65℃保溫20min加入300ul酚/氯仿/異戊醇抽提（25：24:1），5000rmp離心10min取上清液，加入300ul氯仿/異戊醇（24:1）抽提，5000rmp離心10min取上清液，加入300ul的異丙醇，顛倒混勻，室溫下靜止10min，沉淀DNA，5000rmp離心10min加500ul70%乙醇洗沉淀，5000rmp離心10min1棄上清液，待酒精揮發(fā)盡后加30ulTE溶解1溶解于20ulTE中，20℃保存。【實驗原理】在實時定量實驗中，反應是在PCR產(chǎn)物的擴增達到固定熒光水平時的循環(huán)期間時間點來描述的，而不是在固定循環(huán)次數(shù)后累積的PCR產(chǎn)物最終數(shù)量來描述。首先，軟件通過計算歸一化報告熒光信號強度（與基線循環(huán)相對應的Rn值）的數(shù)學趨勢，生成一個基線簡化擴增曲線。1）ExperimentName（實驗名稱）。（可不填）5）選擇Quantitation（定量）實驗類型6）Next（下一步）定義方法和材料在Methodsamp。標準曲線實驗確定樣本中靶序列的絕對量。?標準品－數(shù)量已知的樣本。陰性對照應不會擴增。Reagents（TaqMan試劑）。TaqMan探針設計用于雜交靶，并在擴增靶時產(chǎn)生熒光信號。SYBRGreen試劑包括兩個引物和SYBRGreen染料。如果使用SYBRGreen染料：選擇IncludeMeltCurve（包括解鏈曲線）以執(zhí)行擴增靶的解鏈曲線分析。–如果為PCR反應使用Fast試劑，則選擇Fast(~40MinutestoCompleteaRun)（快速（約40分鐘完成運行））。設置靶在Targets（靶）屏幕上，輸入您想在PCR反應板中定量的靶數(shù)量，然后為每個靶設置檢測。建議反應板中的每個靶檢測設置一條標準曲線。–如果要將FAMTM染料加在您用于檢測靶的TaqMan探針的5′端，則選擇FAM。–如果您正使用SYBR174。–如果您正使用SYBRGreen染料，則選擇None（無）。1）單擊Howmanypointsdoyouneedforeachstandardcurve?（每條標準曲線您需要多少個點？）字段，然后輸入5。3）為RNaseP（示例）檢測定義標準品數(shù)量范圍：（輸入起始量）字段，然后輸入10000。（選擇序列倍數(shù)）下列菜單中，選擇1:2。4）查看StandardCurvePreview（標準品曲線預覽）窗格。1）單擊Howmanysamplesdoyouwanttotestinthereactionplate?（您想在反應板中檢測多少樣本？）字段，然后輸入2。建議對每個靶檢測進行三次陰性對照反應。（顏色）字段中的默認設置。7）在WellCount（反應孔數(shù)）窗格中，確認存在：?6個未知反應孔U?15個標準品反應孔S?3個陰性對照反應孔N?24個空反應孔8）在ViewPlateLayout（查看檢