【正文】 將一些蛋白質混合物分開。 （三） 蛋白質的分離純化： （ 1） 前處理：將蛋白質從動、植物或細菌的組織或細胞中以溶解狀態(tài)釋放出來，并保持天然狀態(tài)，不丟失生物活性，如用適當緩沖液提取蛋白質，離心除去雜質。 s 常用來近似描述生物大分子的大小，蛋白質、核酸、核糖體和病毒的沉降系數介于 1 1013到 200 1013sec范圍，見 293 表 74。 血紅蛋白含鐵 也是 %，最低分子量也為 16700，但用其它方法測分子量為68000，即每一個血紅蛋白含有 4 個鐵原子，由此計算更為準確分子量為： 167004=66800。 值得注意的是血紅蛋白分子四條肽鏈共 574 個氨基酸殘基，只兩個 β 鏈上的氨基酸被代替（ 2Glu→ 2Val），即引起如此嚴重疾病。鐮刀狀細胞貧血病是血紅蛋白分子突變引起的。 2. BPG 降低 Hb 對氧親和力： BPG 可由糖代謝產生，正常人血液中約含 ，約與血紅蛋白等摩爾數。 （ 4） H+， CO2 和 BPG（ 2， 3二磷酸甘油酸）對血紅蛋白結合氧的影響 ： 它們與 Hb 結合部位離血紅素基甚遠，是通過別構效應調節(jié) Hb 與氧的結合。 ③ Δ Y：氧飽和百分數變化；Δ P（ O2）：氧分壓變化。 當 Y=0，所有氧合部位空著； Y=1，所有氧合部位被氧占據； Y=，半載，此時所需氧分壓大小為對氧親和 力指標。 氧與血紅蛋白結合是協(xié)同進行的，具有正協(xié)同性同促效應，即一個氧分子與 Hb結合，使同一 Hb 分子中其余空的氧結合部位對氧親和力增加，再結合第二、三、四個氧分子則比較容易。 血紅蛋白與肌紅蛋白結構上最大不同在于血紅蛋白有四級結構，是四聚體，而肌紅蛋白只有三級結構。結合氧只發(fā)生暫時電子重排。分子中多肽鏈由 8 段 α 螺旋組成，分子結構致密結 實，帶親水基團側鏈的氨基酸分布在分子外表面，疏水氨基酸側鏈幾乎全埋在分子內部，見 P253 圖61。 第六章、蛋白質結構與功能的關系（ P252） 本章的重點：這也是蛋白質化學中最為重要的一章，要求學生重點掌握，特別是蛋白質結構和功能的關系及其研究在生命科學中的重要地位。 （ 4） 四級結構對稱性：是四級結構蛋白主要性質之一，有旋轉對稱軸，如二聚體，四聚體。 （ 2） 四級結構締合的驅動力：弱相互作用（氫鍵、疏水相互作用，范氏力，鹽鍵），有的亞基聚合還借助亞基之間的二硫橋，如抗體是由兩條重鍵和兩條輕鏈組成的四聚體，二硫鍵將兩條重鏈與輕鏈連接在一起， P276 圖 629。 根據分子生物學一個中心原理：順序規(guī)定構象，活性依靠結構，蛋白質結構是可預測的。 P235 圖 549。 變性是一個協(xié)調過程，在所加變性劑很窄的濃度范圍內，或很窄的 pH 或溫度區(qū)間內突然發(fā)生。球狀蛋白表面上的疏水空穴常用于結合底物、效應物等配體，為行使生物功能的活性部位。 結構域形成再締合成三級結構動力學更為合理，特定三維排布的結構域形成，有利于結構域之間活性中心的形成，結構域之間的柔性肽鏈形成的鉸鏈區(qū)有利于活性中心與底物結合，以及別構中心結合調節(jié)物發(fā)生別構效應。常構成酶的活性部位和蛋白質的功能部位。為第一個氨基酸殘基的羰基與第四個殘基的 NH 氫鍵鍵合，形成一緊密的環(huán)在肽鏈回折或彎曲時形成，使多肽鏈出現(xiàn) 1800 急劇回折，見 P211 圖 519。 氫鍵：在不同的肽鏈間或同一肽鏈的不同肽段間形成，氫鍵與肽鏈長軸接近垂直。 Poly Ile 由于 R 基大，雖不帶電也不易形成。 ） 2. 每圈螺旋含約 個氨基酸殘基，由 H 鍵封閉的環(huán)中原子數為 13，此種 α 螺旋又稱 ，每周螺距為 ， R 基均在螺旋外側， P208 圖 514。 常見的二級結構組件： α 螺旋，β 折迭片，β 轉角和無規(guī)卷曲。 （二） 穩(wěn)定蛋白質三維結構的作用力 （ 1） 弱相互作用（或稱非共價鍵，或次級鍵） 1. 氫鍵 2. 疏水作用（熵效應） 3. 范德華力 4. 離子鍵（鹽鍵） （ 2） 共價二硫鍵 （三） 酰胺平面和二面角 P 205 圖 511 （ 1） 酰胺平面（肽平面）：肽鍵上的四個原子和相連的 Cα 1 和 Cα 2 所在的平面。 ③ 多肽鏈與環(huán)境水（必須水）形成氫鍵。 現(xiàn)在越來越多的蛋白質氨基酸序列是由核酸的核苷酸順序推定的，但仍需氨基酸序列分析配合。 （八） 二硫橋位置的確定 用切點多的胃蛋白酶水解肽鏈，生成比較小的含二硫橋的肽段混合物，將樣品點在濾紙中央，在 進行第一向電泳分離。 （ 2） 質譜法：電噴射電離（ ESI），見 P178 圖 411。由此進行氨基酸序列自動分析，進行幾輪反應就能測出幾個殘基序列。 糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：肽鍵羧基端為芳香族氨基酸，如 Phe、 Trp、或 Tyr，以及疏水氨基酸 Leu、 Met 或 His。 測出 Asx 和 Glx，酰胺基總量由水解液中 NH4Cl 量計算出。 （三）二硫鍵斷裂： 用變性劑，如 8mol/L 尿素或 6mol/L 鹽酸胍使蛋白質變性，分子內部 SS露出，并用 HSCH2CH2OH 處理，則 SS變成 2 個 SH，再用碘乙醇保護 SH 不被氧化， P172 圖 48。 （ 2） C末端分析 ① 肼解法：蛋白質或多肽與無水肼加熱發(fā)生肼解反應，除 C末端氨基酸以游離形式存在外，其余氨基酸都變成相應的氨基酸酰肼化物。 PTH (phenylthiohydantoin)： 苯乙內酰硫脲。 ② 丹磺酰氯（ DNS）法：有熒光，靈敏度高。 6. 確定二硫鍵位置。 2. 每一多肽鏈氨基酸組成：鑒定 N末端殘基和 C末端殘基，定出氨基酸序列參考點。來自任兩個物種的細胞色素 C 間序列的氨基酸差異數目越多則進化位置相差越遠。蛋白質中氨基酸順序是由基因決定的，是聯(lián)系 DNA 遺傳信息和蛋白質生物功能的橋梁。 ACE DRVYIHPFHL(AngⅠ ) DRVYIHPF(AngⅡ )。 二十六肽：蜂素溶血肽，抗關節(jié)炎。 十肽：短桿菌肽，見 P532，為抗生素。 蛋氨酸腦啡肽 TyrGlyGlyPheMet。 甜二肽 Aspartame AspPheOCH3，比蔗糖甜 200 倍。雙縮脲： H2NCONHCONH2 ， P163。 （ 3） 化學反應 ① 與茚三酮在弱酸性溶液中共熱顯紫色，為 α NH2 反應（注意：伯胺也可使茚三酮顯紫色），氨基酸、多肽均有此反應。以 GlyGluLysAla 四肽為例 (P166表 46)： ① 當 pH ，末端可解離基團全部質子化， 2 個 +NH 2 個 COOH，凈電荷 +2； ② pH ， C末端 COOH 解離（ pKa =），為 2 個 +NH一個 COOH、一個COO，凈電荷 +1； ③ pH ~， Glu 的 γ COOH 解離， 2 個 +NH 2 個 COO(pKa=)，為等電點，凈電荷為 0； ④ ~， N 末端 +NH3 解離（ pKa=），一個 +NH 一個 NH2 、 2 個 COO、凈電荷 1； ⑤ pH， ε +NH3 解離， 2 個 NH 2 個 COO，凈電荷 2。 一般氨基酸數目 12~20 的肽為寡肽（小肽）； 20 的肽為多肽。 寡聚蛋白是由兩條或多條多肽鏈構成，其中每條多肽鏈稱為亞基或亞單位。 功能來自構象： 為表達蛋白質結構上不同組織層次，一般采用下列專門術語： 1. 一級結構：又稱化 學結構，指蛋白質多肽鏈氨基酸連接在一起的順序，包括二硫鍵位置，為共價鍵連接的全部情況。 8. 防御和進攻：免疫球蛋白，毒蛋白如蛇毒。 4. 貯存：如種子中谷蛋白，蛋中卵清蛋白。 （二） 蛋白質功能 生物界蛋白質種類估計有 1010~1012種， 20 種氨基酸全排列為 Anm=2020。 平均 含氮量為 16% 蛋白質含量 = 蛋白氮 從細菌到人類所有物種的蛋白質都由這一組 20 種氨基酸構成。 比旋光為氨基酸物理常數之一，但隨 pH 值變化常見氨基酸比旋光度可用來鑒 別氨基酸， P144 表 34 （三） 氨基酸的紫外吸收 λ max(nm) ε （摩爾消光系數） Phe 257 102 Tyr 275 103 Tvp 280 103 蛋白質在 280nm 波長下測光吸收，光吸收值越大，相對純度越高，常用在蛋白質提純過程。 等電點 pH 值計算： pI=1/2(pKa+173。 （ 1） 按 R 基化學結構分類 1. 脂肪族氨基酸 15 個 ① . 中性氨基酸 5 個 甘氨酸 Glycine 氨基乙酸 Gly G 無旋光 丙氨酸 Alanine α 氨基丙酸 Ala A 纈氨酸 Valine α 氨基 β 甲基丁酸 Val V 亮氨酸 Leusine α 氨基 γ 甲基戊酸 Leu L 異亮氨酸 Isoleucine α 氨基 β 甲基戊酸 Ile I ② . 含羥 基或硫氨基酸 4 個 絲氨酸 Serine α 氨基 β 羥基丙酸 Ser S 蘇氨酸 Threonine α 氨基 β 羥基丁酸 Thr T 半胱氨酸 Cysteine α 氨基 β 基丙酸 Cys C 甲硫氨酸 Methionine α 氨基 γ 甲硫基丁酸 Met M ③ ． 酸性氨基酸及其酰胺 4 個 天冬氨酸 Aspartic acid α 氨基丁二酸 Asp D 谷氨酸 Glutamic acid α 氨基戊二酸 Glu E 天冬酰胺 Asparagine α 氨基丁二酸一酰胺 Asn N 谷氨酸胺 Glutamine α 氨基戊二酸一酰胺 Gln Q ④ . 堿性氨基酸 2 個 賴氨酸 Lysine α ， ε 二氨基已酸 Lys K 精氨酸 Arginine α 氨基 δ 胍基戊酸 Arg R 2. 芳香族氨基酸 3 個 苯丙氨酸 Phenylalanine α 氨基 β 苯 基丙酸 Phe F 酪氨酸 Tyrosine α 氨基 β 對羥苯基丙酸 Tyr Y 色氨酸 Tryptophan α 氨基 β 吲哚基丙酸 Trp W 3. 雜環(huán)族氨基酸 2 個 組氨酸 Histidine α 氨基 β 咪唑基丙酸 His H 脯氨酸 Proline α 吡咯烷羧酸 Pro P （ 2） 按 R 基極性性質分類 1. 非極性 R 基 8 個 Ala(A) Val(V) Leu(L) Ile(I) Pro(P) Phe(F) Trp(W) Met(M) 2. 極性不帶電 R 基 7 個 Gly(G) Ser(S) Thr(T) Cys(C) Tyr(Y) Asn(N) Gln(Q) 3. 帶正電荷 R 基 3 個 Lys(K) Arg(R) His(H) 4． 帶負電荷 R 基 2 個 Asp(D) Glu(E) 另外 Asx(B)： Asp(D)， Asn(N) Glx(Z)： Glu(E)， Gln(Q) 兩個 Cys 常氧化形成胱氨酸 Cystie （ 二 ） 不常見蛋白質氨基酸 P128 為相應常見氨基酸修飾而來 ， 如 ： 5羥賴氨酸 ， 4羥哺氨酸 ， γ 羧基谷氨酸 ， 焦谷氨酸 ， 磷酸絲氨酸 ， 甲狀腺素等。 酶水解 不消旋破壞，但水解不徹底。 ?生物化學技術的改進。第二節(jié)結束前課介紹一點氨基酸的種類結構和功能。也要介紹很多諾貝爾獎獲得者的工作所起的歷史性作用，爭取體起學生學習《生物化學》的興趣，介紹重要雜志和國內外的教材。 ?著名生物化學家的作用。 堿水解 得色氨酸，其余氨基酸消旋破壞。按側鏈 R 基不同進行分類。