【正文】 住載玻片在火焰上加熱約 5min（當(dāng)染料冒蒸汽時(shí)開始計(jì)時(shí)）。染色 完畢，用自來水沖洗。用水沖洗后，應(yīng)甩去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－簡(jiǎn)單染色方法 菌名 染色液名稱 菌體顏色 菌體形態(tài)（圖示） 大腸埃希氏菌 金黃色葡萄球菌 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－革蘭氏染色法 陽性菌 陰性菌 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－革蘭氏染色法 注意事項(xiàng)： ? 單一菌落染色后看到紅色桿菌和紫色桿菌共存的情況，特別明顯既有紅色的，也有紫色的？（ 脫色時(shí)間 ：受涂片之厚薄、脫色時(shí)玻片晃動(dòng)的快慢及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。 ? 負(fù)染色法 ：負(fù)染色法是一種特殊的染色方法，是指背景著色而細(xì)菌本身不著色。 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－染色分類 ? 單染色法 ：用一種染色劑對(duì)涂片進(jìn)行染色。 ? 固定 ：標(biāo)本干燥后即進(jìn)行固定，標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快地來回通過3～ 4次，共 2～ 3s，并不時(shí)以載玻片的加熱面觸及皮膚，其 目的 ：殺死微生物，固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)；保證菌體能牢固地黏附在載玻片上，防止標(biāo)本被水洗掉；改變?nèi)玖蠈?duì)細(xì)胞的通透性，因?yàn)樗兰?xì)胞的原生質(zhì)比活細(xì)胞的原生質(zhì)易于染色。 ? 單純?nèi)玖希?不能與被染物生成鹽類 影響染色的因素 ? 細(xì)菌的結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜的通透性、膜孔的大小 ? 培養(yǎng)基：組成、菌齡、 pH 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－制片方法 制片： （制片是染色的關(guān)鍵，如不注意菌體涂布的均勻度，會(huì)造成染料的大面積堆積，而使觀察結(jié)果不理想） ? 制片： 在干凈的載波片（平時(shí)放在 95%酒精中 )上滴一滴蒸餾水或無菌水，用接種工具進(jìn)行無菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中與水混合做成懸液，并涂成直徑約 1cm的薄層。 菌名 懸滴法或水封片法 細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)方式 判斷有、無鞭毛 普通變形桿菌 銅綠假單胞菌 黃色金葡萄球菌 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－染料 細(xì)菌染色用的染料 ? 酸性染料 （陰離子染料）：染色離子帶陰電荷，能與帶陽電的物質(zhì)結(jié)合，使之著色。鏡檢時(shí)要仔細(xì)辨別是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)還是分子運(yùn)動(dòng)（即布朗運(yùn)動(dòng)） 不染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－壓滴法（水封片法） ? 制水封片：加 1滴菌液于潔凈無油的載玻片中央，然后取 1滴潔凈的蓋玻片，先使其一邊接觸菌液，再慢慢地放下蓋玻片，這樣可防止產(chǎn)生氣泡。 ? 滴加菌液： 加 1滴菌液于蓋玻片的中央，并用削尖的記號(hào)筆在菌液的邊緣做一記號(hào)，以便在顯微鏡觀察時(shí)，易于尋找菌液的位置。 ?無菌間只允許放置無菌操作臺(tái)、轉(zhuǎn)椅、水浴鍋；無菌操作臺(tái)上最多只允許擺放以下物品： 物 品 數(shù) 量 物 品 數(shù) 量 酒精燈 1個(gè) 滅菌 營(yíng)養(yǎng)瓊脂 200ml 打火機(jī) 1個(gè) 滅菌 雙料發(fā)酵管 6根 接種針 1個(gè) 滅菌 單料發(fā)酵管 12根 消毒面團(tuán) 1瓶 滅菌 平皿 10塊 洗耳球 1個(gè) 試管架 2副 鑷子 1個(gè) 2ml滅菌吸管 5根 油筆 1支 10ml滅菌吸管 3根 試管簍 2個(gè) 125ml滅菌燒杯 2個(gè) 微生物檢測(cè)作業(yè)規(guī)范 ?微生物培養(yǎng) 24小時(shí)后，當(dāng)班微檢員仔細(xì)觀察、如實(shí)填寫培養(yǎng)的現(xiàn)象，任何異常情況都必須及時(shí)報(bào)告；晚班的微檢員可將有異常情況的培養(yǎng)液交接給白班，并保證其免受污染。 ?進(jìn)入無菌間作業(yè)時(shí)必須做到： ?緩沖間、無菌間的紫外燈開啟時(shí)間超過半小時(shí)； ?關(guān)閉紫外燈后，微檢員把作業(yè)過程中將用到的所有物品放在緩沖間，同時(shí)在緩沖間更換專用的工作衣，同時(shí)佩戴口罩和衛(wèi)生帽，然后再將物品轉(zhuǎn)移到無菌間； ?作業(yè)時(shí)關(guān)閉紫外燈、空調(diào)、和無菌操作臺(tái)風(fēng)機(jī)；每次最多做 4個(gè)樣品。 ?已殺菌未開封的培養(yǎng)液在 24小時(shí)內(nèi)可直接使用；已殺菌未開封超過 24小時(shí)或者已殺菌但開封而未用完的培養(yǎng)液都必須重新殺菌后使用。 ? 每月進(jìn)行一次維護(hù)檢查，并填寫維護(hù)記錄 。 超凈工作臺(tái)的使用 ? 使用工作臺(tái)時(shí)，先經(jīng)過清潔液浸泡的紗布擦拭臺(tái)面，然后用消毒劑擦拭消毒。使用電爐或酒精燈加熱時(shí)應(yīng)堅(jiān)持有人看管和監(jiān)視。其次還應(yīng)必須有上下水設(shè)施、通風(fēng)櫥（在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行對(duì)發(fā)生出有害氣體的分析操作）。 （ 2）室內(nèi)應(yīng)有足夠的照明條件。 檢驗(yàn)室建設(shè)要求 ? 選址與規(guī)模 （ 1）化驗(yàn)室應(yīng)建設(shè)在遠(yuǎn)離粉塵、噪聲、散發(fā)異味氣體等地點(diǎn)，電源電壓應(yīng)當(dāng)相對(duì)穩(wěn)定的地點(diǎn)。 ? 衣服或易燃品著火：應(yīng)先斷絕火源或電源，搬走易燃物品 (乙醚、汽油等 )，再用濕布掩蓋滅火，或?qū)⑸眢w靠墻或著地滾動(dòng)滅火，必要時(shí)可用滅火器。如污染了致病菌，應(yīng)將手浸于 2％～ 3％來蘇爾或 %新潔爾滅溶液中，經(jīng) 10～ 20min后洗凈。 ?實(shí)驗(yàn)完畢，立即關(guān)閉煤氣，整理和擦凈臺(tái)面，離開實(shí)驗(yàn)室之前要用肥皂洗手。 ?凡須進(jìn)行培養(yǎng)的材料，都應(yīng)注明菌名、接種日期及操作者姓名（或組別），放在指定的溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，按時(shí)觀察并如實(shí)地記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按時(shí)交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。 ?接種時(shí)不要走動(dòng)和講話：接種時(shí)盡量不要走動(dòng)和講話，以免因塵埃飛揚(yáng)和唾沫四濺而導(dǎo)致雜菌污染。 ?非必要的物品不要帶進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，必須帶進(jìn)的物品（包括帽子、圍巾等）應(yīng)放在不影響實(shí)驗(yàn)操作的地方 ?每次實(shí)驗(yàn)前須用濕布擦凈臺(tái)面，必要時(shí)可用 ％ “ 新潔爾滅 ” 溶液擦。 5．禁止在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)吸煙、進(jìn)餐、會(huì)客、喧嘩，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不得帶入私人物品，離開實(shí)驗(yàn)室前認(rèn)真檢查水、電、暖氣、門窗，對(duì)于有毒、有害、易燃、污染、腐蝕的物品和廢棄物品應(yīng)按有關(guān)要求執(zhí)行。 實(shí)驗(yàn)室管理制度 1．實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定儀器配備管理使用制度，藥品管理使用制度，玻璃器皿管理使用制度，并根據(jù)安全制度和環(huán)境條件的要求，本室工作人員應(yīng)嚴(yán)格掌握，認(rèn)真執(zhí)行。 ? 認(rèn)識(shí)和熟悉微生物檢驗(yàn)中常用儀器設(shè)備（尤其是普通光學(xué)顯微鏡）及其結(jié)構(gòu)與性能，能正確使用和進(jìn)行一般的維護(hù)。 ? 菌落總數(shù)（個(gè) /1g、 1cm、 1cm2 )：清潔狀態(tài)的標(biāo)志；預(yù)測(cè)食品可能存放的期限 . ? 大腸菌群 (MPN/100ml):較為理想的糞便污染的指標(biāo)菌群；作為腸道致病菌污染食品的指示菌 . ? 致病菌 (不得檢出）：沙門氏菌、肉毒梭菌、志賀氏菌、變形桿菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌、霉菌 ? 霉菌及其毒素：我國(guó)還沒有制定出霉菌的具體指標(biāo)，鑒于有很多霉菌能夠產(chǎn)生毒素，引起疾病，故應(yīng)該對(duì)產(chǎn)毒霉菌進(jìn)行檢驗(yàn)。 ? 對(duì)于發(fā)生腐敗變質(zhì)的罐頭食品，必須根據(jù)腐敗變質(zhì)的現(xiàn)象作微生物學(xué)分析，如是否產(chǎn)氣脹罐，是否渾濁沉淀，是否變酸或 pH 上升等等，以便作出正確判斷，避免腐敗變質(zhì)的進(jìn)一步發(fā)生。 罐藏食品的腐敗變質(zhì) ? 罐藏食品也會(huì)發(fā)生腐敗變質(zhì)，其原因在于殺菌不徹底，罐內(nèi)仍殘留有一定量的微生物，或者罐頭密封不良而漏罐，外界進(jìn)入微生物。腌魚由于嗜鹽細(xì)菌的生長(zhǎng)而有橙色出現(xiàn)。同時(shí)可產(chǎn)生各種異味，如哈喇味、酸味、泥土味和惡臭味等。 肉、魚、蛋類的腐敗變質(zhì) ? 禽畜肉類的微生物污染，一是在宰殺過程中各個(gè)環(huán)節(jié)上的污染，二是病畜、病禽肉類所帶有的各種病原菌，如沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、結(jié)核桿菌、布魯氏菌（ Brucella ）等。這些病原菌可能產(chǎn)生毒素而易引起中毒。主要有乳酸細(xì)菌、胨化細(xì)菌、脂肪分解細(xì)菌、酪酸細(xì)菌、產(chǎn)氣細(xì)菌、產(chǎn)堿細(xì)菌、以及酵母和霉菌。果汁變質(zhì)后會(huì)呈現(xiàn)渾濁、產(chǎn)生酒精和有機(jī)酸變化，結(jié)果原有風(fēng)味被破壞或產(chǎn)生一些不愉快的異味。在外觀上出現(xiàn)深色斑點(diǎn)，組織變松、變軟、凹陷，漸成液漿狀，并出現(xiàn)酸味、芳香味或酒味等。這時(shí)食物中的蛋白質(zhì)就被破壞了，食物會(huì)發(fā)出臭味和酸味，失去了原有的堅(jiān)韌性和彈性，顏色也會(huì)發(fā)生變化從而造成食品變質(zhì)。 ? 皮膚：表皮葡萄球菌、類白喉?xiàng)U菌、綠膿桿菌、恥垢桿菌等 ? 口腔： 球菌（甲型或乙型）、乳酸桿菌、螺旋體、梭形桿菌、白色念球菌、（真菌）表皮葡萄球菌、肺炎球菌、奈瑟氏球菌、類白喉?xiàng)U菌等 ? 胃：正常一般無菌 ? 腸道：類桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、厭氧性鏈球菌、糞鏈球菌、葡萄球菌、白色念球菌、乳酸桿菌、變形桿菌、破傷風(fēng)桿菌、氣莢膜桿菌等 ? 鼻咽腔：甲型鏈球菌、奈氏球菌、肺炎球菌、流感桿菌、乙型鏈球菌、葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、變形桿菌等 ? 眼結(jié)膜 ： 皮表葡萄球菌、結(jié)膜干燥桿菌、類白喉?xiàng)U菌等 微生物引起食品腐敗變質(zhì) ? 食品中含有蛋白質(zhì)，脂肪，碳水化合物，這些成份是微生物的生長(zhǎng)基質(zhì)，所以微生物在食品中能夠生長(zhǎng)繁殖。 ? 國(guó)家規(guī)定，自來水中，細(xì)菌總數(shù)每毫升不得超過 100個(gè)，大腸菌群不得超過 3個(gè) /升 . 食品中的微生物 －－來自空氣 ? 在冬春季節(jié)，更容易發(fā)生感冒等傳染病，就是因?yàn)榭諝獾膫鞑ィ貏e是在公共場(chǎng)所，人多，空氣流通差，細(xì)菌多； ? 大城市上空微生物數(shù)量最多，鄉(xiāng)村少；森林、草地和田野上空空氣清潔，海洋、高山、冰雪覆蓋的地面上空，微生物更為稀少。水中微生物種類及數(shù)量因水源不同而異。 ? 土壤是微生物的天然培養(yǎng)基，它具備微生物正常發(fā)育所必須的一切條件：土壤中含有一定的無機(jī)物和有機(jī)物；土壤中含有適當(dāng)?shù)乃?；大多?shù)中性偏堿 ,適合大多數(shù)微生物生長(zhǎng)；土壤中還含有氣體，主要是 CO O2和 N2；溫度變化不大（ 1025℃ ）。 ? 了解評(píng)價(jià)食品質(zhì)量的主要標(biāo)準(zhǔn)。 ? 了解不同微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求有不同，因此，不同食品的變質(zhì)，引起其變質(zhì)的微生物類群有不同。 ? 歐洲 “ 二噁英 ” 、 “ 瘋牛病 ” （ 20世紀(jì) 90年代） ? 日本大腸桿菌 O157:H7中毒（ 1996） ? 中國(guó) SARS（ 2022） 、東南亞國(guó)家禽流感（ 2022） ? 美國(guó)菠菜大腸桿菌 O157:H7污染事件（ 2022） 食品中的微生物 －－來自土壤 ? 自然界中微生物的分布極為廣泛，水中、高山、海底、荒漠、極地、空氣等到處都生存著各種各樣、形形色色的微生物。 食品中的微生物 －－來自水源 ? 水也是微生物存在的天然環(huán)境，水中的細(xì)菌來自土壤、塵埃、污水、人畜排泄物及垃圾等。 ? 井水和泉水中細(xì)菌少，雨水、雪水中也少，城市上空的雨水細(xì)菌多，鄉(xiāng)村上空雨水細(xì)菌少。在正常人體皮膚、粘膜及外界相通的各種控道（如口腔、鼻咽腔、腸道和泌尿道）等部位，存在著對(duì)人體無害的微生物群，包括細(xì)菌、真菌、螺旋體、支原體等。只要溫度適宜，微生物就會(huì)生長(zhǎng)繁殖，分解食物中的營(yíng)養(yǎng)素，以滿足自身需要。起初霉菌在果蔬表皮，或其污染物上生長(zhǎng)，然后霉菌侵入果蔬組織，首先分解細(xì)胞壁中的纖維素，進(jìn)一步分解其中的果膠、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、淀粉、糖類等，使其變成簡(jiǎn)單物質(zhì)。果汁常見的霉菌是青霉，其次是曲霉。 ? 鮮乳中污染微生物主要來源于乳房?jī)?nèi)的污染微生物和環(huán)境中的微生物。但原料奶污染嚴(yán)重，加工又不當(dāng)?shù)哪谭壑锌赡芪廴居猩抽T氏菌（ Salmonella ）和金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus ）等病原菌。 ? 微生物引起甜煉乳變質(zhì)也有三種結(jié)果：一是由于微生物分解甜煉乳中蔗糖產(chǎn)生大量氣體而發(fā)生脹罐；二是許多微生物產(chǎn)生的凝乳酶使煉乳變稠；三是霉菌污染時(shí)會(huì)形成各種顏色的鈕扣狀干酪樣凝塊，使甜煉乳呈現(xiàn)金屬味和干酪味等。然后分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的 H 2 S 與血紅蛋白形成硫化氫血紅蛋白而變成暗綠色，也由于各種微生物生長(zhǎng)而產(chǎn)生不同色素，霉菌生長(zhǎng)形成各種霉斑。新鮮魚類變質(zhì)后組織疏松，無光澤，由于組織分解產(chǎn)生的吲哚、硫醇、氨、硫化氫、糞臭素等，而常有難聞惡臭。它們使鮮蛋成為散黃蛋，并進(jìn)一步分解產(chǎn)生硫化氫、氨、糞臭素等，蛋液成灰綠色，惡臭或粘附于蛋殼、蛋膜上。如罐頭中未殺滅的是厭氧性梭狀芽孢桿菌，則可能會(huì)進(jìn)行丁酸發(fā)酵，并產(chǎn)生氫氣和 CO 2 ，不產(chǎn)芽孢細(xì)菌的污染主要是由于罐頭漏罐所引的，它們使罐頭內(nèi)食品發(fā)生渾濁、沉淀風(fēng)味改變和產(chǎn)氣脹罐。我國(guó)衛(wèi)生部頒布的食品微生物指標(biāo)有菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌三項(xiàng)。 食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀及趨勢(shì) ? 我國(guó)食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)質(zhì)量控制工作現(xiàn)狀分析 ； ? 食品微生物診斷新技術(shù) 食品微生物檢驗(yàn)條件 學(xué)習(xí)目標(biāo)： ? 了解微生物檢驗(yàn)室的基本要求，通過學(xué)習(xí)，能獨(dú)立建設(shè)一般的食品微生物檢驗(yàn)室。為達(dá)此目的，房屋的墻壁和地板，使用的各種家具都要符合便于清洗的要求。 4．各種器材應(yīng)建立請(qǐng)領(lǐng)消耗記錄，貴重儀器有使用記錄，破損遺失應(yīng)填寫報(bào)告；藥品、器材、菌種不經(jīng)批準(zhǔn)不得擅自外借和轉(zhuǎn)讓，更不得私自拿出，應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行 《 菌種保管制度 》 。初步熟悉實(shí)驗(yàn)操作的主要步驟和環(huán)節(jié)，對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的安排做到先后有序、有條不紊和避免差錯(cuò)。為此，在實(shí)驗(yàn)過程中，每個(gè)人要嚴(yán)格做到以下幾點(diǎn)： ?操作時(shí)要預(yù)防空氣對(duì)流：在進(jìn)行微生物實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，要關(guān)閉門窗，以防空氣對(duì)流。 ?要穿干凈的白色工作服：微生物學(xué)工作者在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)穿上白色工作服，離開時(shí)脫去，并經(jīng)常洗滌以保持清潔。 ?各種儀器應(yīng)按要求操作，用畢按原樣放置妥當(dāng)。 ? 菌液污染手部皮膚：先用 70%乙醇棉花拭凈，再用肥皂水洗凈。 ? 致病菌：如吸入白喉棒桿菌，在用②法處理后，在注射 1000U白喉抗毒素作緊急預(yù)防；若吸入傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌