限制性內(nèi)切酶酶切的常見問題及解決方法-全文預(yù)覽
【正文】 DNA，使用可靠試劑盒或可靠手工提取試劑， 酶的問題：確認(rèn)內(nèi)切酶有效 [很多內(nèi)切酶雖然有過期時間，但過期后只要能夠有效酶切，可用。限制性內(nèi)切酶酶切的常見問題及解決方法限制性內(nèi)切酶酶切的常見問題及解決方法，個人覺得總結(jié)得很好，特供大家分享。可在上面找到酶單位定義、保存條件、酶切體系[buffer及與其它酶雙切的buffer等]、酶切反應(yīng)溫度[有些酶是在50、55或30等溫度下反應(yīng)的]、酶是否受甲基化影響、是否有星號活性及出現(xiàn)星號活可能因素、保護(hù)性堿基1. 酶切不開或不完全 質(zhì)粒問題 純度差或殘留酶切抑制物最為常見 。并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油緩沖液中，溫度過低時，酶會發(fā)生凍結(jié)（運輸過程例外，由于酶需要低溫運輸，所以方便的情況下是使用干冰，酶會凍結(jié)，但凍結(jié)次數(shù)有限，相對是一種比較好的選擇），如果是經(jīng)常使用的話，酶會被反復(fù)凍融，從而降低了活性。因為實驗室有些同學(xué)，酶取出后是放在冰盒上的，但有兩點忽略了：拿酶的時候，手不是抓著管子上端，而握在管子的底部，相當(dāng)于用手在給酶進(jìn)行加熱；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的時候，還是將酶拿出來。個人認(rèn)為的可能原因是由于在配置酶切反應(yīng)時，酶管的蓋子在較長時間的開著，甘油會吸取空氣中的水分，對于常用的大包裝的酶有時就會出現(xiàn)凍結(jié)現(xiàn)象。那么我們必要非常注意動作，要么就換用另一種長的 tips，專門去酶液用。通常，這種影響不大，但如果是使用一些對離子濃度敏感的內(nèi)切酶時就會出現(xiàn)問題。一些酶切位點被甲基化后，酶切會受影響。時，Xba I的位點才會被甲基化，并非所有的Xba I位點都會出現(xiàn)甲基化。SiteEnzyme Activity Blocked?AarIpartiallyApaIpartiallyApaIpartiallyBclI 酶切或雙酶切時，保護(hù)性堿基及近末端位點堿基個數(shù)的問題。關(guān)于相關(guān)的資料可以參見：[針對PCR產(chǎn)物酶切位點保護(hù)性堿基的資料][針對載體酶切位點近末端位點堿基個數(shù)對酶切影響的資料]2. 質(zhì)粒酶切時出現(xiàn)smear。減少酶用量、合適的反應(yīng)溫度、不進(jìn)行長時間的酶切反應(yīng)，可減少星活性的出現(xiàn)。感謝amberly戰(zhàn)友的支持和提議, 尤其感謝wht5945戰(zhàn)友對“內(nèi)切酶熱失活溫度”、“星號活性”以及“酶切位點保護(hù)堿基”等內(nèi)容的補(bǔ)充與整理。一些在65℃下不能失活的酶如將溫度升高至80℃，溫育20分鐘也可失活。若瓊脂糖電泳顯示底物部分或完全被消化，則表明該酶沒有完全被熱失活。酶識別特異性的改變受酶本身的性質(zhì)及可能引起星號活性的反應(yīng)條件影響。只要在正常條件下，使用隨酶提供的NEBuffer，NEB的酶就不會出現(xiàn)星號活性。較高的甘油濃度（5% v/v）；2.g）；3.高pH值（pH ）5.用其他二價離子替代鎂離子（如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等）以上因素的影響程度因酶的不同而有所不同。盡量用較少的酶進(jìn)行完全消化反應(yīng)。盡量避免有機(jī)溶劑（如制備DNA時引入的乙醇）的污染。限制性內(nèi)切酶保護(hù)堿基:限制性內(nèi)切酶識別特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白還要占據(jù)識別位點兩邊的若干個堿基，這些堿基對內(nèi)切酶穩(wěn)定的結(jié)合到DNA雙鏈并發(fā)揮切割DNA作用是有很大影響的，被稱為保護(hù)堿基。也就是說，保護(hù)性堿基的設(shè)計，除了要考慮“堿基個數(shù)”外，“堿基組成”也是要考慮的。我做了一次酶切,雖然有目的條帶(載體和目的基因,目的基因不是很明顯,相反在其下方的條帶更明顯),也就是說有雜帶,請問這結(jié)果的肯能原因.我的菌株是從其他老師那里得來的,提取出來的質(zhì)粒好象比理想的要大(理想4000左右,跑出來的比5000大).雙酶切質(zhì)粒載體很明顯(pUC2700左右),就是目的基因1400位置比較模糊(還是有),900左右位置卻更明顯,而且下方還有雜帶. 按道理不應(yīng)該酶把目的基因切斷. 請問可能的原因有哪些啊,.1. “理想4000左右,跑出來的比5000大” —— 質(zhì)粒是否經(jīng)過單酶切處理？如果只是簡單的將質(zhì)粒進(jìn)行電泳，數(shù)據(jù)是不具有參考意義的。根據(jù)各種不同的條件，酶切反應(yīng)的設(shè)計一般應(yīng)注意以下問題：1. 大多數(shù)限制酶貯存在50％甘油溶液中，以避免在20℃條件下結(jié)冰。3. 反應(yīng)體系中Mg2+是限制酶僅有的共同因子，當(dāng)用其它二價陽離子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA時，酶活
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