【正文】 圖 32 酶的 pH穩(wěn)定性 在相同溫度下，漆酶 相對(duì) 酶活隨 pH 的變化如圖 31 所示 ， 漆酶的最適反應(yīng) pH 值為 3。于 420nm處測(cè)定其吸光光度值， 酶液最后加加完后立即 測(cè)定，測(cè)定漆酶與底物反應(yīng) 1min的吸光度 。 mε）（ TV247。做出 lac的酶促動(dòng)力學(xué)曲線，計(jì)算酶活。 C 預(yù)熱 10min 后混合測(cè)酶活。 其中 40 三組設(shè)定 24h 的對(duì)照 。 C， 12022r/min，離心 20min，棄沉淀，取上清液，此即為測(cè)酶活所用的粗酶液。接菌完成后，用封口膜封好連接口，移入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度設(shè)定為 28，在無(wú)光條件下培養(yǎng) 10 天，每天觀察菌的生長(zhǎng)情況。 第 4 頁(yè) 共 14 頁(yè) 第 2 章 材料和方法 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 木蹄層孔菌（ 東北林業(yè)大學(xué)遺傳學(xué) 實(shí)驗(yàn)室提供） 、試劑 馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、麥麩、玉米、木屑、 可溶性淀粉、麥芽糖、酵母汁、 蛋白胨、牛肉膏 、ABTS(1mM)、檸檬酸 檸檬酸鈉緩沖液（ pH3）、 75%的酒精 . 表 21 微量溶液 的配制 藥品 含量 /L MgSo4 3g MnSo4 Nacl 1g Cacl2 CuSo4 Kal(So4) 10mg 10mg 次氮基三乙酸酯（ NTA） 表 22 液體培養(yǎng)基 配制 藥品 含量 /L 白樺木屑 10g 酒石酸銨 KH2PO4 2g 第 5 頁(yè) 共 14 頁(yè) MgSO4 CaCl2 琥珀酸（二）甲酯 10mM() 微量元素 70ml 硫胺素（ VB1） 1mg 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、恒溫箱、烘箱、高壓濕熱滅菌鍋、干熱鼓風(fēng)超凈臺(tái)、可調(diào)控溫度搖床、冰箱、刀、鍋、電磁爐、打孔器、鑷子、三角瓶、燒杯、容量瓶、棕色試劑瓶、移液槍、離心管、高速冷凍離心機(jī)、離心機(jī)、磁力攪拌器、酸度計(jì)。白腐菌漆酶具有廣泛的底物專(zhuān)一性，可以氧化芳香環(huán)化合物，對(duì)紡織染料的脫色及降解效果明顯。利用這種方法培養(yǎng)木耳、香菇等將有益于節(jié)約成本和擴(kuò) 大生產(chǎn)規(guī)模 [14]。 目前 ， 漆酶介導(dǎo)系統(tǒng)己經(jīng)得到了實(shí)際應(yīng)用 [12]。 的應(yīng)用 造紙工藝中 需要去除木質(zhì)素 ， 傳統(tǒng) 高溫蒸煮去除木質(zhì)素的 紙漿得率低且污染環(huán)境 ， 而 漆酶能選擇性地催化木質(zhì)素降解的這個(gè)特性可用于紙漿生產(chǎn)， 減少環(huán)境污染，杜絕廢水。 漆酶的作用底物具有較大的廣譜性，初步統(tǒng)計(jì)，漆酶催化氧化不同類(lèi)型的底物已達(dá) 250 個(gè)，而且還有增加的趨勢(shì)，底物結(jié)構(gòu)大致可歸納如下 [l2]：酚類(lèi)及其衍生物 : 如 2， 6— 二甲氧基酚，愈創(chuàng)木酚等 。在 O2存在下，還原態(tài)漆酶被氧化， O2 被還原為水。 就酚類(lèi)化合物和芳香胺類(lèi)化合物而言，漆酶利用氧分子作為電子受體，從被氧化的底物分子中，通過(guò)單電子提取方式從多酚類(lèi)化合物的 o位和 p位的 OH和芳胺中去除一個(gè) H原子，形成自由基，該自由基不穩(wěn)定，進(jìn)一步發(fā)生聚合或解聚反應(yīng)，引起重排 、 二聚 、 烷基 芳基斷裂 、 芐醇氧化 、 側(cè)鏈和芳環(huán)的斷裂或生成醌等一系列的非酶促反應(yīng) 。 由于漆酶底物的廣泛和人們對(duì)漆酶介質(zhì)的不斷研究，漆酶的商業(yè)用途也越來(lái)越廣泛。在 ABTS 存在時(shí)，能氧化木質(zhì)素中的非酚型單元，并且其催化過(guò)程不需要 H2O2 參與，因此它在催化木質(zhì)素降解時(shí)有一定的優(yōu)越性 [9]。目前，對(duì)木蹄層孔菌的研究主要是對(duì)其甲醇、乙醇、乙酸乙 酯 、氯仿、石油醚、正丁醇的提取物的抗腫瘤活性進(jìn)行研究 [5]。分布于我國(guó)香港、廣東、廣西、云南、貴州、河南、陜西、四川、湖南、湖北、山西、河北、內(nèi)蒙 古、甘肅、吉林、遼寧、黑龍江、西藏、新疆等地區(qū) [2]。多呈 灰色，灰褐、淺褐色至黑色，有一層厚的角質(zhì)皮殼及明顯環(huán)帶和環(huán)梭，邊緣鈍。它們生長(zhǎng)在 北美洲 及 歐洲 的 樺木屬 及 水青岡屬 。 Enzyme activity stabilization are under 40 176。 10mM/L 的 Ba2+、 Ca2+、 Co+、 Fe3+、 Na+、 K+這六個(gè)金屬離子對(duì)漆酶酶活有較強(qiáng)的抑制作用，其中 Fe3+的抑制作用最強(qiáng)，而 Mg2+， Cu2+對(duì)兩種漆酶均有激活作用。I 木蹄層孔菌 Lac 的酶學(xué)性質(zhì)研究 摘 要 本文對(duì)木蹄層孔菌漆酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。C 酶活性基本全部喪失 ；在pH 值 ~4 范圍內(nèi)保持相對(duì)較高的酶活力。 The optimal pH value is 3。 Within the scope of the pH value of ~ 4 remained relatively high enzyme activity. 10 mm/L Co+, Ca2+, Ba2+, Fe3+, Na+, K+ the six metal ions on laccase enzyme activity had a stronger inhibitory effect, one of the strongest inhibitory effect of Fe3+, and Mg 2+, Cu2+ effect on two kinds of laccase are activated. ABTS as substrates, laccase Km value tendency for L. Key words: tinder fungus， laccase， enzymatic properties III 目 錄 第 1 章 緒論 ........................................................................ 1 木蹄層孔菌國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展 ...................................................... 1 漆酶國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展 ............................................................ 1 .............................................................. 2 ................................................................ 3 第 2 章 材料和方法 .................................................................. 4 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 ................................................................ 4 ...................................................................... 4 、試劑 ............................................................ 4 .................................................................. 5 實(shí)驗(yàn)方法 ...................................................................... 5 .......................................................... 5 .............................................................. 5 .............................................................. 6 ............................................................ 7 第 3 章 結(jié)果與分析 .................................................................. 8 最適反應(yīng) pH 值及 pH 穩(wěn)定性 ...................................................... 8 最適溫度及熱穩(wěn)定性 ............................................................ 9 金屬離子及抑制劑對(duì)漆酶活性的影響 ............................................. 10 ........................................................................... 10 第 4 章 討論 ....................................................................... 12 致 謝 ............................................................................. 13 參考文獻(xiàn) .......................................................................... 14 第 1 頁(yè) 共 14 頁(yè) 第 1 章 緒論 木蹄層孔菌國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展 木蹄層孔菌 (Fomes fomentarius(L.:Fr.)Kick.)是一種多孔菌科的高等藥用真菌，是世界性分布的木腐性真菌 [1]。子實(shí)體大至巨大，馬蹄形，無(wú)柄。 往往在生境陰濕或較黑暗的生境出現(xiàn)棒狀畸形子實(shí)體。國(guó)內(nèi)外對(duì)木蹄的研究結(jié)果表明，木蹄具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和抗氧化等功效。 漆酶國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展 漆酶即多酚氧化酶，是一種藍(lán)色多銅氧化酶家族的糖蛋白氧化酶，它利用分子氧作為氧化劑，氧化木質(zhì)素中酚型單元成為酚氧游離基，同時(shí)還原分子氧生成水。白腐真菌漆酶通常以多重基因編碼的同工酶形式出現(xiàn)，有來(lái)源廣泛、單第 2 頁(yè) 共 14 頁(yè) 電子氧化還原電位高、可以催化降解多環(huán)芳烴類(lèi)物質(zhì)等特點(diǎn) [10]。 漆酶催化苯酚類(lèi)