細胞生物學研究方法 (2)-全文預覽
【正文】 率： 橫向為 ~，縱向可達 。聚焦電子束與試樣相互作用，產生二次電子發(fā)射。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。 應用： 適用于顆?；蚶w維等游離的樣品。約為細胞的 1/200厚度。 (3)脫水 ：標本必須置于高真空中進行電鏡觀察 ,所以電鏡生物標本不能含水。 由于散射的電子不參加成像，故標本中密度大的部分成像后形成電子流量減少的暗區(qū)；相反密度小的部分散射電子少而形成明區(qū)。 ◆由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等 5部分構成。 （六）微分干涉顯微鏡 A普通明視場顯微鏡； B相差顯微鏡； C微分干涉顯微鏡 微分干涉顯微鏡以平面偏振光為光源 。只有從樣品發(fā)出的散射光才能進入物鏡被放大 ,在暗的背景中呈現明亮的像。 ⑵相差顯微鏡 細胞內的各結構可 因密度不同 而產生相位差 (即光程差 )，不過人眼無法鑒別這種微小的變化。 ⑶ 應用 : 5. 綠色熒光蛋白 green fluorescent protein GFP 載體 (GFP基因＋待定位蛋白基因 ) 導入特定的細胞 熒光顯微鏡下觀察 待定蛋白質在細胞內的位置分布 特異蛋白質生物大分子定位 觀察過氧化物酶體 GFP ＋過氧化物體內的酶（有定位信號） 導入不同細胞 熒光顯微鏡下觀察各種細胞的過氧化物酶體 （三）激光共聚焦掃描顯微鏡 （ Laser confocal scanning microscope, LCSM） 顯微 CT 激光作掃描光源 掃描焦平面上樣品，得樣品切面像 載物臺上微量步進馬達使載物臺上下移動 ,改變焦平面 得不同層次的切面圖像 計算機圖像三維重組獲樣品立體圖像 分辨率：因激光束波長較短，光束很細，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨率，約是普通光鏡的 3倍。 核 :blue 線粒體 :green 肌動蛋白 :red 200ng/ml ADM 處理 BNLCL2后細胞微絲骨架的熒光觀察 對照組 ⑴ 原理 : 熒光抗體與標本切片中組織或細胞的抗原進行反應，在熒光顯微鏡下觀察到明亮的特異熒光。 ： A 光源 B 二向色鏡：反射短波光線，透過長波光線 C 一組濾光片：得到純的激發(fā)光和發(fā)射光 熒光顯微鏡光路圖 3. 熒光的觀察 : 1. 自發(fā)熒光 某些天然物質本身能發(fā)出熒光，如葉綠素。 第二步 . 脫水 第三步 . 包埋（ embed） 目的：包埋使組織變得堅硬 ,便于切片。 ——普通光線的波長為 400 ～ 700nm，分辨力數值不會小于 ，人眼的分辨力為 ,因此顯微鏡的最大設計倍數為 1000X。 數值孔徑與顯微鏡的分辨率有密切關系， ?越短， N?A越大， 分辨率越高。第三章 細胞生物學研究方法 Chapter 3 Methods and Techniques in Cell Biology Preparatory observe put forward theoretics Design control tests Collect data Explain results Devise conclusion Refer to knowledge 生物學研究一般規(guī)律 Outline 第三節(jié) 細胞培養(yǎng)及細胞工程 一、動物細胞的分離及培養(yǎng) 二、植物細胞的培養(yǎng) 三、細胞工程 （一）細胞融合與細胞雜交技術 （二）單克隆抗體技術 （三）細胞顯微技術 第四節(jié) 模式生物 第一節(jié) 形態(tài)學研究方法 一、光學顯微鏡技術 二、電子顯微鏡技術 三、掃描隧道顯微鏡技術 第二節(jié) 細胞組分的分析方法 一、細胞組分的分離 二、細胞組分的化學染色 三、放射自顯影技術 四、顯微分光光度技術 五、分子雜交技術 六、流式細胞技術 七、免疫學方法對細胞組分的分析 第一節(jié) 形態(tài)學研究方法 一、光學顯微鏡技術 （一）普通光學顯微鏡及其標本的制備 （二）熒光顯微鏡及其應用 （三）掃描激光共聚焦顯微鏡及其應用 （四）相差顯微鏡 （五）暗視場顯微鏡 （六）微分干涉顯微鏡 （七）熒光能量共振轉移技術 （八）熒光漂白恢復技術 構成 ①照明系統(tǒng)： 光源 ②光學放大系統(tǒng)：物鏡、目鏡、聚光器和光闌 ③機械裝置： 鏡筒、物鏡轉換器、鏡臂鏡座、 載物臺、調焦螺旋 Olympus顯微鏡的結構圖 （一）普通光學顯微鏡 原理 ： 經物鏡形成倒立實像，經目鏡進一步放大成像。A = nsin (?/2), 叫物鏡的數值孔徑。 D= / nsin (?/2) D：分辨率 λ :光波的波長 n:介質折射率 α :物鏡鏡口角 (標本在光軸的一 點對于物鏡鏡口的張角 ) ——sinα/2 的最大值必然小于 1；介質為空氣，鏡口率一般為 ～ ；油鏡頭用香柏油為介質，鏡口率可接近 。 試劑：甲醛、戊二醛 機
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