【正文】 % 第二節(jié) 酶工程在食品工業(yè)中的應(yīng)用 （ 一 ） 淀粉糖加工 淀粉酶 （ ） 淀粉內(nèi)切酶，能隨機(jī)水解直鏈或支鏈淀粉分子 α 1,4糖苷鍵生成不同長度的寡糖，液化淀粉速度快，最終產(chǎn)物為 α 極限糊精和少量的葡萄糖及麥芽糖。 應(yīng)的相對速度。 （３） 固定化酶： 有機(jī)相中固定化后載體對酶的影響 中底物和產(chǎn)物的局部濃度。 有些在水中不能實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)途徑，在有機(jī)介質(zhì)中卻成為主導(dǎo)反應(yīng)。 （二）活性 單相共溶劑體系中，有機(jī)溶劑對酶活性影響 （ 1） 有機(jī)溶劑直接作用于酶 （ 2） 有些酶的活性會隨著某些有機(jī)溶劑濃度升高而增大，在某一濃度（最適濃度）達(dá)到最大值；若濃度再升高，則活性下降。 (3)對酶的直接影響，溶解于水層中的溶劑分子可以抑制處于水中的酶或使酶失活，酶與兩相界面的直接接觸也可導(dǎo)致酶的失活 2．選擇有機(jī)溶劑必須考慮因素 (1)有機(jī)溶劑與反應(yīng)的匹配性（即相容性） 包括反應(yīng)產(chǎn)物與溶劑的匹配性，極性產(chǎn)物傾向于保留在酶附近，可能引起產(chǎn)物抑制或不必要的副反應(yīng)發(fā)生。因此非水體系又稱低水體系。 必需水 (Essential Water)： 維持酶催化活性所必須的最少量的水。 （一）有機(jī)相酶反應(yīng)具備條件 1． 保證必需水含量。同時由于底物和產(chǎn)物的高脂溶性，使它們在酶分子表面的實(shí)際濃度較低 , 可以減少底物或產(chǎn)物對酶引起的抑制作用。 (2) 在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以改變酶促反應(yīng)的熱力學(xué)平衡向有利于合成方向（而不是水解方向）進(jìn)行。 優(yōu)點(diǎn)： 1)酶在有機(jī)介質(zhì)中由于水分子的減少，相對來說酶分子的構(gòu)象表現(xiàn)出比水溶液中更具有“ 剛性 ” 特點(diǎn)。 膜反應(yīng)器 連續(xù)式 游離酶 固定化酶 清洗比較困難 噴射式反應(yīng)器 連續(xù)式 游離酶 通入高壓噴射蒸汽，實(shí)現(xiàn)酶與底物的混合，進(jìn)行高溫短時催化反應(yīng)，適用于某些耐高溫酶的反應(yīng) 1984年 A. Zaks 和 Klibanov 首次發(fā)表了關(guān)于非水相介質(zhì)中脂肪酶的催化行為及熱穩(wěn)定性的研究報道，引起了廣泛的關(guān)注。 填充床式反應(yīng)器 連續(xù)式 固定化酶 密度大，可以提高酶催化反應(yīng)的速度。 膜反應(yīng)器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纖維型、轉(zhuǎn)盤型等多種形狀。 四、鼓泡式反應(yīng)器 (bubble column reactor, BCR ) 利用從反應(yīng)器底部通入的氣體產(chǎn)生的大量氣泡，在上升過程中起到提供反應(yīng)底物和混合兩種作用的一類反應(yīng)器，是一種無攪拌裝置的反應(yīng)器。 適用于固定化酶進(jìn)行連續(xù)催化反應(yīng)。 ? 缺點(diǎn)是：傳質(zhì)和熱系數(shù)相對較低，固定化酶顆粒大小會影響壓降和內(nèi)擴(kuò)散阻力。 適于有底物抑制場合 。 分類： 按結(jié)構(gòu)分為： 攪拌罐式反應(yīng)器 鼓泡式反應(yīng)器 填充床式反應(yīng)器 流化床式反應(yīng)器 膜反應(yīng)器 噴射反應(yīng)器 按操作方式： 間歇（分批）式 連續(xù)式 半連續(xù)式（包括流加） 理想型： 連續(xù)操作活塞式反應(yīng)器（ CPFR） 連續(xù)操作攪拌式反應(yīng)器（ CSTR） （一）攪拌罐式反應(yīng)器（ Stirred Tank Reactor, STR） 組成： 反應(yīng)罐 攪拌器 保溫裝置 分類： 分批攪拌罐式反應(yīng)器 流加分批攪拌罐式反應(yīng)器 連續(xù)攪拌罐式反應(yīng)器 分批攪拌罐式反應(yīng)器 (BSTR) 將酶和底物溶液一次性加到反應(yīng)器中，在一定條件下反應(yīng)一段時間，然后將反應(yīng)液全部取出。 （五）固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： 極易將產(chǎn)物和底物分開；可以在較長時間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng)；在大多數(shù)情況下，可以提高酶的穩(wěn)定性；酶反應(yīng)過程可以嚴(yán)格控制；產(chǎn)物中沒有酶的殘留，簡化了工業(yè)設(shè)備；較水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)；可以增加產(chǎn)物的收得率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量；酶使用效率提高，成本降低。 它與載體結(jié)構(gòu) 、 顆粒大小 、底物相對分子質(zhì)量及酶的結(jié)合效率有關(guān) 。在一般情況下，固定化后酶的失活速度下降，最適溫度也隨之提高。它是衡量固定化酶操作穩(wěn)定性的關(guān)鍵。在選用固定化細(xì)胞作為催化劑時，應(yīng)考慮到底物和產(chǎn)物是否容易通過細(xì)胞膜，膜內(nèi)是否存在產(chǎn)物分解系統(tǒng)和其他副反應(yīng)系統(tǒng)，或者說雖有這兩種系統(tǒng)，但是否可事先用熱處理或pH值調(diào)整等簡單方法使之失效。 （ 二 ） 細(xì)胞的固定化方法 細(xì)胞固定化的主要方法有用載體對細(xì)胞的包埋法和利用載體與細(xì)胞之間吸引力的吸附法兩種。常與交聯(lián)法結(jié)合達(dá)到加固的目的，如先用明膠包埋，再用戊二醛交聯(lián)等。 缺點(diǎn)：僅適用于小分子底物和產(chǎn)物的酶，因?yàn)橹挥行》肿游镔|(zhì)才能擴(kuò)散進(jìn)入高分子凝膠的網(wǎng)格，并且這種擴(kuò)散阻力還會導(dǎo)致固定化酶動力學(xué)行為的改變和酶活力的降低。 特點(diǎn)：反應(yīng)條件比較激烈，固定化酶的活力回收率較低，但盡量降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時間，會有助于固定化酶比活力的提高。 （ 2） 共價交聯(lián)法 。 （ 1）共價結(jié)合法。通過離子效應(yīng)，將酶分子固定到含有離子交換基團(tuán)的固相載體上。吸附的載體：包括無機(jī)載體（活性炭、石英砂、多孔玻璃、氧化鋁、硅膠、磷酸鈣）和有機(jī)載體（淀粉、谷蛋白、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）等。 :反應(yīng)結(jié)束后，酶即使仍有活性，也難以回收，成本提高，難于連續(xù)化生產(chǎn)。 酶偶聯(lián)法 指選擇另一種酶與酶發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，即第一種酶 E1所催化的產(chǎn)物作為 E2的底物，通過測定第二個酶促反應(yīng)產(chǎn)物的量變化來測的活力，此法適用于活力不高或所催化產(chǎn)物不便測定的一些酶活力測定。幾乎所有的酶都可根據(jù)這一原理，設(shè)計出測定其活力的具體方法。 如蛋白酶的活力，可據(jù)酶催化酪蛋白水解生成的酪氨酸與酚試劑作用藍(lán)色反應(yīng)，再用比色法測定之。 比活力：每毫克酶蛋白具有的酶活力單位數(shù)。 ，為選擇適當(dāng)方法和條件提供了直接依據(jù)。 （五）酶分離純化的原則 這一原則要貫穿純化工作的始終，在后期尤為重要?？梢苑蛛x和檢出等電點(diǎn)相差僅 。電泳分離的蛋白質(zhì)量通常較小（約數(shù)毫克），常用作分析用。 離子交換劑根據(jù)活性基團(tuán)的性質(zhì)分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。超濾膜截留的顆粒直徑范圍為 2～ 200nm，相當(dāng)于相對分子質(zhì)量 1000～ 500000。透析結(jié)束時，透析袋內(nèi)的保留液體積較大，濃度較低。 透析膜可用動物膜、羊皮紙、火棉膠或塞璐玢等制成。 在酶液中加入某些高分子聚合物，例如，單寧，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，分離出沉淀后，再用適當(dāng)方法將酶從復(fù)合物中重新析出。 鹽析沉淀所得到的產(chǎn)品常含有大量鹽分，一般可用超濾或?qū)游龅确椒擕}，使酶進(jìn)一步純化。 ③ 提取方法的經(jīng)濟(jì)性和可分析性 盡量減少添加劑的使用 盡早使用高效分離方法 ， 將昂貴 、 費(fèi)時的分離方法放在最后階段 。 酶的純化過程與一般蛋白質(zhì)純化過程相比的特點(diǎn)： 特定的一種酶在細(xì)胞中的含量較少， 酶可以通過測定活力的方法加以跟蹤。 酶的精制 :即高度純化。 自溶法：在微生物生長代謝過程中，控制一定條件，誘發(fā)微生物產(chǎn)生少量的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達(dá)到細(xì)胞自溶的目的。 （一）機(jī)械破碎法 適合于細(xì)菌和酵母的破碎，不適合于絲狀真菌及某些基因工程菌。 固定化細(xì)胞發(fā)酵 三、微生物細(xì)胞的破碎 胞外酶：能分泌透過細(xì)胞壁到細(xì)胞外部的酶。 （ 3）產(chǎn)酶量高，而且最好產(chǎn)生胞外酶。 酶的系統(tǒng)編號： ?例如： ?習(xí)慣名稱 :谷丙轉(zhuǎn)氨酶 ?系統(tǒng)名稱 :丙氨酸： ?酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶 ?酶催化的反應(yīng) : ?谷氨酸 + 丙酮酸 ?? ?酮戊二酸 + 丙氨酸 工業(yè)酶制劑的命名和分類 分類： 碳水化合物酶、蛋白質(zhì)酶、酯酶和其他酶 如 α－淀粉酶 高轉(zhuǎn)化率糖化酶（葡萄糖淀粉酶） 一些習(xí)慣歸類： 動物酶、植物酶、微生物酶 胞內(nèi)酶和胞外酶 溶液酶和固定化酶 二、酶制劑的生產(chǎn) 、產(chǎn)酶菌種的分離、篩選、育種和酶的發(fā)酵生產(chǎn)等。 H O O C C H = C H C O O H H 2 O H O O C C H 2 C H C O O HO H5．異構(gòu)酶 (Isomerase) ? 此類酶為生物代謝需要對某些物質(zhì)進(jìn)行分子異構(gòu)化，分別進(jìn)行外消旋、差向異構(gòu)、順反異構(gòu)等，分為差相異構(gòu)酶、消旋酶、順反異構(gòu)酶等 6．連接酶（合成酶） (Ligase or Synthetase) ?合成酶，又稱為連接酶，能夠催化 CC、 CO、 CN 以及 CS 鍵的形成反應(yīng)。 ?主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。 ?如，乳酸 (Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。 1969 日本固定化氨基酰化酶，第一次將固定化酶成功地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。 一、酶工程概述 酶工程是現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分。它包括酶、細(xì)胞固定化技術(shù)、酶化學(xué)修飾技術(shù)和酶反應(yīng)器設(shè)計等。 1949 大規(guī)模工業(yè)化階段（液體深層發(fā)酵）細(xì)菌淀粉酶 70年代后期，酶的固定化技術(shù)取得了突破，使固定化酶、固定化細(xì)胞、生物反應(yīng)器與生物傳感器等酶工程技術(shù)迅速獲得應(yīng)用。 ?主要包括脫氫酶 (dehydrogenase)和氧化酶 (Oxidase)、過氧化氫酶、氧合酶、細(xì)胞色素氧化酶。 C H 3 C H C O O HN H 2H O O C C H 2 C H 2 C C O O HOH O O C C H 2 C H 2 C H C O O HN H 2C H 3 C C O O HO3．水解酶 (Hydrolase) H 2 OC O O C H2 C H 3R R C O O H C H 3 C H 2 O H?水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)（或逆反應(yīng)）。 ?例如， 延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。 ? 丙酮酸 + CO2 ? 草酰乙酸 酶用于生物催化的概況 類別 占總酶比例 % 利用率 % 水解酶 hydrolases 26 65 氧化還原酶oxidoreductases 27 25 轉(zhuǎn)移酶 transferases 24 5 裂合酶 lyases 12 ~5 異構(gòu)酶 isomerases 5 ~1 連接酶 ligases 6 ~1 國際系統(tǒng)命名法 ?系統(tǒng)名稱包括底物名稱、構(gòu)型、反應(yīng)性質(zhì)，最后加一個酶（ ase）字。 （ 2）不易退化，不易感染噬菌體。 液體深層發(fā)酵 液體培養(yǎng)基，在發(fā)酵容器中，經(jīng)滅菌、冷卻接入產(chǎn)酶細(xì)胞，在一定條件下發(fā)酵，是目前酶生產(chǎn)的主要方法。破碎的目的是將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破壞掉，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來，包括機(jī)械破碎法和非機(jī)械破碎法。 （二）非機(jī)械破碎法 加酶法 :常用的有溶菌酶、蛋白酶、糖苷酶等，它們對細(xì)胞壁或細(xì)胞膜進(jìn)行酶解，使細(xì)胞破碎。常用的方法：鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取、有機(jī)溶劑提取。 分離： 將酶從原料中抽提出來 ， 并盡可能少引入雜質(zhì) ， 得到粗酶液 純化： 將酶和雜質(zhì)中分離開來 ， 或者有選擇地將酶從包含雜質(zhì)中分離出來 ， 得到一定純度的酶 。 策略： ① 酶產(chǎn)品的質(zhì)量要求 設(shè)定目標(biāo)： （ 用途：醫(yī)用 、 食品級 、 工業(yè)級或研究級 ） 目標(biāo)酶蛋白與主要雜質(zhì)的性質(zhì) ② 提取過程的設(shè)計應(yīng)盡可能防止酶的損失 ，減少處理步驟 。其中以硫酸銨最為常用，因?yàn)樗谒械娜芙舛却蠖鴾囟认禂?shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價廉易得。常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙酮、甲醇等。常用的凝膠有瓊脂糖凝膠（ Sepharose）、聚丙烯酰胺凝膠（ Biogel）和葡聚糖凝膠（ Sephadex）等。 缺點(diǎn)：時間長，若不更換水或緩沖液時，只擴(kuò)散到膜內(nèi)外平衡為止。 借助于超濾膜將不同相對分子質(zhì)量的物質(zhì)分離的技術(shù)，是在一定的正壓力或負(fù)壓力驅(qū)動下，將料液強(qiáng)制通過一定孔徑的超濾膜，部分小分子的溶質(zhì)和溶劑透過膜而成為超濾液，而大分子的酶和蛋白質(zhì)等物質(zhì)被截留，從而達(dá)到分離純化的目的，也可用于酶液的濃縮和脫色。不同離子交換劑上的可解離基團(tuán)對各種離子的親和力不同，而使不同物質(zhì)分離。為了減少對流擴(kuò)散，電泳過程一般在浸透了緩沖液的聚丙烯酰胺凝膠、淀粉膠等介質(zhì)上進(jìn)行。 優(yōu)點(diǎn)：不但可將各種酶精確分開，通過測定各段的 pH值還可以了解該酶的等電點(diǎn)。 利用抗