【正文】 蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分離純化，從中除去小分子物質(zhì)。使用時(shí)可做成透析管、透析袋或透析槽等形式。 （二）根據(jù)酶分子大小和形狀不同的方法 在酶的提取分離純化過(guò)程中，細(xì)胞的收集、細(xì)胞碎片和沉淀的分離以及酶的純化等往往要使用離心分離。 在酶的沉淀分離中，等電點(diǎn)沉淀法經(jīng)常與鹽析沉淀、有機(jī)溶劑沉淀和復(fù)合沉淀等方法一起使用，使其沉淀完全。 酶活力 、 蛋白濃度 、 純度測(cè)定方法可行性 ④ 劑型 （ 液體濃縮酶 、 粉狀酶 、 精制酶 、結(jié)晶酶等 ） 基本過(guò)程： （一）、 材料（選擇）預(yù)處理及破碎細(xì)胞 （二）、 固液分離（ 離心或過(guò)濾） 酶的溶解性、穩(wěn)定性 （三）、 凈化與脫色 絮凝劑 脫色處理 （四）、 濃縮 （熱量法、沉淀分離、膜分離） （五） 純化、結(jié)晶 （干燥） 提取和純化方法： （一）根據(jù)酶分子溶解度不同的方法 通過(guò)改變某些條件，使溶液中某種物質(zhì)的溶解度降低，從溶液中沉淀析出，達(dá)到與其他物質(zhì)分離的目的。 前者給純化帶來(lái)了困難，而后者卻迅速找出純化過(guò)程的關(guān)鍵所在。常用的方法：沉淀法、超濾法、色譜分離法、結(jié)晶法等。 用有機(jī)溶劑 、 變性劑 、 表面活性劑 、 抗生素或金屬螯合物等處理 ， 使細(xì)胞壁或膜的通透性（ 滲透性 ） 改變 ， 從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來(lái) 。 適合于各種微生物細(xì)胞的破碎。 胞內(nèi)酶：存在于細(xì)胞內(nèi)部的酶。 （ 4）能利用廉價(jià)的原料，發(fā)酵周期短，易培養(yǎng)。 （ 1）不能是致病菌，特別是對(duì)食品用酶和醫(yī)藥用酶。這類(lèi)反應(yīng)必須與 ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。 ?例如，脂肪酶 (Lipase)催化的脂的水解反應(yīng)： 4．裂合酶 (Lyase) ?裂合酶催化從底物分子中移去一個(gè)基團(tuán)或原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。 2．轉(zhuǎn)移酶 (Transferase) ?轉(zhuǎn)移酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個(gè)底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)底物的分子上。 —— 酶工程誕生 ，各種酶工程技術(shù)已用于制造多種精細(xì)化工產(chǎn)品和醫(yī)藥產(chǎn)品，并且在食品工業(yè)、化學(xué)檢測(cè)和環(huán)境保護(hù)等各個(gè)領(lǐng)域中得到了有效的應(yīng)用。 以微生物或酶 為催化劑進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)化的工業(yè)生物技術(shù)，大規(guī)模生產(chǎn)人類(lèi)所需的化學(xué)品、醫(yī)藥、能源和材料等，是解決人類(lèi)目前面臨的資源、能源及環(huán)境危機(jī)的有效手段。酶工程原理及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用 第一節(jié) 酶工程原理和方法 （一）酶工程的定義 利用 酶、菌體細(xì)胞 具有的特異催化功能，或?qū)γ附Y(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾改造，并借助于生物反應(yīng)器和工藝優(yōu)化過(guò)程，有效地發(fā)揮酶的催化特性來(lái)生產(chǎn)人類(lèi)所需產(chǎn)品的技術(shù)。 酶工程一般工藝流程示意圖 胞外酶 胞內(nèi)酶 菌種 → 基因改造 → 發(fā)酵 → 發(fā)酵酶液 （ → 預(yù)處理 → 細(xì)胞分離 → 細(xì)胞破壁 → 碎片分離 → ） 提取 → 精制 → 酶制劑及其改造 酶制劑 ↓ 原料 → 前處理 → 殺菌 → 酶反應(yīng)器 → 反應(yīng)液 → 產(chǎn)品提取→ 成品 （二）酶工程的發(fā)展歷程 50～ 60年代早期的酶工程技術(shù)，主要是從動(dòng)物、植物和微生物原料中提取、分離、純化制造各種酶制劑，并將其應(yīng)用于化工、食品和醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域。 酶的非水相催化 新酶的開(kāi)發(fā) （三）酶的分類(lèi)： 按酶催化反應(yīng)的類(lèi)型分類(lèi) ?1．氧化還原酶 ?2．轉(zhuǎn)移酶 ?3．水解酶 ?4．裂合酶 ?5．異構(gòu)酶 ?6．連接酶（合成酶） 1．氧化還原酶 (Oxidoreductase) C H 3 C H C O O HO HN A D + H +C H 3 C C O O HON A D H?催化氧化 還原反應(yīng)，轉(zhuǎn)移氫或加氧。 參與生物物質(zhì)的代謝 例如， 谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。 ?主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。 ?A + B + ATP + HOH ===A ? B + ADP +Pi ?例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)。目前認(rèn)為可用于食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)的生產(chǎn)菌種有：枯草桿菌、黑曲霉、米曲霉、啤酒酵母和脆壁克魯維酵母。 固體培養(yǎng)發(fā)酵 培養(yǎng)基以麩皮、米糠等為主要原料加入其它營(yíng)養(yǎng)成分，經(jīng)滅菌、接產(chǎn)酶菌株，在一定條件下發(fā)酵，目的獲得淀粉酶和蛋白酶，如酒曲生產(chǎn)。 對(duì)于胞內(nèi)酶的提取，需要破碎技術(shù)，胞外酶則無(wú)需破碎。 對(duì)桿菌的破碎較容易，對(duì)酵母菌的破碎效果較差。 四、酶的提取與純化 酶的提取 :在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過(guò)程，也稱(chēng)作酶的抽提，即初步純化。其中沉淀法和超濾法既可用于初步純化，也可用于精制。 理想的提取和分離純化方法 ：在提高酶的比活的同時(shí)，要求酶回收率高，提取步驟少、工藝簡(jiǎn)單，成本低。 通常采用的鹽有硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。 利用酶等物質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使其分離。 利用具有一定大小網(wǎng)狀的凝膠顆粒（固定相）填充柱的分子篩作用，利用溶液中各組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同來(lái)進(jìn)行層析分離的一種方法。 優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便。透析在酶純化過(guò)程中極為常用，通過(guò)透析可以除去酶液中的鹽類(lèi)、有機(jī)溶劑、低相對(duì)分子質(zhì)量的抑制劑等。 （ 三 ） 根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的方法 根據(jù)被分離物質(zhì)與分離介質(zhì)（離子交換劑）間異種電荷的靜電引力的不同來(lái)進(jìn)行物質(zhì)分離的。 在外電場(chǎng)作用下，不同蛋白質(zhì)離子所帶凈電荷的多少和性質(zhì)不同，因而其向兩極泳動(dòng)的方向和速度也不相同，從而達(dá)到分離的目的。 先從陽(yáng)極頂端擴(kuò)散裝入一種酸（如磷酸），然后從陰極端擴(kuò)散裝入一種堿（如乙醇胺），用具有不同等電點(diǎn)的脂肪族聚氨基聚羧基化合物作為兩性電介質(zhì)載體，當(dāng)陰陽(yáng)兩極通電以后電介質(zhì)在一定范圍內(nèi)便形成 pH值梯度，當(dāng)該載體電介質(zhì)同樣品一起電泳時(shí)，蛋白質(zhì)便朝其各自等電點(diǎn)相等的 pH值位置移動(dòng)而被濃縮。然后可以通過(guò)改變緩沖液的離子強(qiáng)度和 pH值的方法，也可以使用濃度更高的同一配體溶液或親和力更強(qiáng)的配體溶液，將酶洗脫下來(lái) 。 分離步驟、方法和成本間的關(guān)系 提取、分離、純化、制劑 （六）酶的分離純化應(yīng)注意的問(wèn)題 低溫、不能過(guò)酸、過(guò)堿等。 （七）酶的純度與酶活力 許多分離方法都可用于檢驗(yàn)酶的純度，實(shí)驗(yàn)室常用聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)檢驗(yàn)酶的純度。酶的純度也可用酶的比活力來(lái)衡量。 測(cè)定酶活力可采用中止反應(yīng)法 、 連續(xù)反應(yīng)法 ， 或采用自動(dòng)化酶分析儀操作進(jìn)行 。連續(xù)法使用方便，一個(gè)樣品可多次測(cè)定，但很多酶反應(yīng)不能用該法測(cè)定。 方法：終止法 稀鹽酸 測(cè)吸光度 α淀粉酶可隨機(jī)地作用于淀粉中的 α1,4糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時(shí)使淀粉的粘度降低，因此又稱(chēng)為液化酶。 六、酶的固定化 六、酶的固定化 （一）酶的固定化方法 （ 1）物理吸附法。 缺點(diǎn)：酶與載體結(jié)合力弱、酶易脫落等。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，處理?xiàng)l件溫和，能得到酶活回收率較高的固定化酶。 可與載體結(jié)合的酶的功能團(tuán)： α 或 ε NH2，α 、 β 或 γ 羧基，巰基，咪唑基，酚基等，但參與共價(jià)結(jié)合的氨基酸殘基應(yīng)當(dāng)是酶催化活性的非必需基因，否則可能會(huì)導(dǎo)致固定后酶活力完全喪失。它與共價(jià)結(jié)合法的區(qū)別是它使用交聯(lián)劑而不用載體 。將酶或微生物包埋在高分子凝膠網(wǎng)格中的包埋法稱(chēng)為凝膠網(wǎng)格包埋型，將其包埋在高分子半透膜中的包埋法稱(chēng)為微囊型。采用明膠、卡拉膠、海藻酸鈉或淀粉等天然高分子化合物作為包埋劑時(shí)，可以將酶直接與溶膠態(tài)的包埋劑混合凝膠化。利用各種類(lèi)型的膜將酶封閉起來(lái)，這類(lèi)膜能使小分子產(chǎn)物和底物通過(guò)，而酶和其他的高分子不能通過(guò)。 優(yōu)點(diǎn)：固定化后酶活基本沒(méi)有損失，它還保留了細(xì)胞原有的多酶系統(tǒng)，對(duì)于多步催化轉(zhuǎn)換的反應(yīng)，優(yōu)勢(shì)更加明顯，而且勿需輔酶的產(chǎn)生，直接將微生物細(xì)胞固定化，不僅可以免去提純酶的步驟。 經(jīng)固定化后，大多數(shù)酶的穩(wěn)定性提高，這對(duì)實(shí)際應(yīng)用十分有利。 如果酶反應(yīng)產(chǎn)生酸或消耗酸時(shí) ， pH值曲線會(huì)發(fā)生顯著變化 （ 曲線向右移動(dòng)或向左移動(dòng) ） ， 最適 pH值也會(huì)相應(yīng)變化 。此外，在高離子強(qiáng)度下，酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)幾乎不變。 固定化酶的總活力與用于固定化的酶總活力的百分比。 七、酶反應(yīng)器 生物反應(yīng)器： 利用生物催化劑進(jìn)行生物技術(shù)產(chǎn)品生產(chǎn)的反應(yīng)裝置稱(chēng)為生物催化反應(yīng)器，一般稱(chēng)為生物反應(yīng)器（ Bioreactor） ? 發(fā)酵罐 （ fermenter）：細(xì)胞生物反應(yīng)器 ? 生化反應(yīng)器 （ biochemical reactor） ? 生物反應(yīng)器： 傳統(tǒng)的發(fā)酵罐、酶反應(yīng)器、固定化酶或固定化細(xì)胞反應(yīng)器、動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)用反應(yīng)器和光合生物反應(yīng)器。 連續(xù)攪拌罐式反應(yīng)器 （ Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR） 催化劑采用顆粒狀的固定化酶，少數(shù)應(yīng)用片狀固定化酶。 ? 填充床反應(yīng)器（ Packed Reactor,PBR） ,優(yōu)點(diǎn)是：高效率、易操作、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等，因而， PBR是目前工業(yè)生產(chǎn)及研究中應(yīng)用最為普遍的反應(yīng)器。 三、流化床反應(yīng)器（ FBR） 底物溶液以足夠大的流速向上通過(guò)固定化酶床層，使固體顆粒處于流化狀態(tài)。 FBR可用于處理黏度較大和含有固體顆粒的底物溶度，同時(shí)，亦可用于需要供氣體或排放氣體的酶反應(yīng)（即固、液、氣三相反應(yīng)）。 膜反應(yīng)器（ membrane reactor, MR）可以用于游離酶的催化反應(yīng)，也可以用于固定化酶的催化反應(yīng)。 六、噴射式反應(yīng)器 利用高壓蒸汽的噴射作用，實(shí)現(xiàn)酶和底物的混合，進(jìn)行高溫短時(shí)催化反應(yīng)的一種反應(yīng)器。 流化床反應(yīng)器 分批式 流加分批式 連續(xù)式 固定化酶 流化床反應(yīng)器具有混合均勻，傳質(zhì)和傳熱效果好，溫度和 pH值的調(diào)節(jié)控制比較容易，不易堵塞，對(duì)粘度較大反應(yīng)液也可進(jìn)行催化反應(yīng)。 現(xiàn)在非水酶學(xué)方法在 多肽合成、聚合物合成、藥物合成以及立體異構(gòu)體拆分等 方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景 。 例如在有機(jī)溶劑中，可以利用酶與配體的相互作用性質(zhì)，誘導(dǎo)改變酶分子的構(gòu)象，調(diào)控酶的底物專(zhuān)一性 ,、立體選擇性和手性選擇性等。 (4) 由于有機(jī)溶劑的存在 , 水量減少，大大降低了許多需要水參與的副反應(yīng)，如酸酐的水解、氰醇的消旋化和?；D(zhuǎn)移等。 (8) 由于酶不溶于有機(jī)溶劑中，所以是一個(gè)非均相反應(yīng)體系。 3． 選擇合適的溶劑及反應(yīng)體系。不同酶與必需水結(jié)合的緊密程度及所結(jié)合的必需水量是不同的。 影響酶反應(yīng)體系中需水含的因素 a．不同酶需水量不同 b. 同一種酶在不同有機(jī)溶劑中需水量不同 溶劑疏水性越強(qiáng)，需水量越少 二、有機(jī)溶劑的選擇 有機(jī)溶劑與酶活性： 溶劑主要是通過(guò)對(duì)體系中水、酶以及底物和產(chǎn)物的作用來(lái)間接地或直接地影響酶活性： (1)對(duì)吸附在酶分子上的水分的影響，溶劑可以?shī)Z走吸附在酶分子表面的必需水，破壞了維持酶蛋白構(gòu)象的氫鍵和疏水作用，降低了酶的活性和穩(wěn)定性。 (3)必須考慮的其他因素 溶劑的密度、黏度、表面張力、毒性、廢物處理和成本等（溶劑因底物而宜） 溶劑參數(shù) lgP：即一種溶劑在辛醇 /水兩相間分配系數(shù)的常用對(duì)數(shù)值，它能直接反映溶劑的疏水性。 認(rèn)為：超活性是由圍繞在酶分子外面的表面活性劑這一外殼之較大剛性所引起。 （２） 化學(xué)修飾酶（疏水性修飾、反相膠束）： 例如： SOD酶經(jīng)糖脂修飾后變成脂溶性，它對(duì)溫度、 PH、蛋白酶水解的穩(wěn)定性均高于天然 SOD。 用，可穩(wěn)定酶的催化活性構(gòu)象。 八、酶在微水體系中的應(yīng)用 有機(jī)合成 氧化 光學(xué)活性物質(zhì)的合成 手性藥物的合成 油和脂肪的精制（生物柴油） 生物表面活性劑的合成 肽的合成 其他的專(zhuān)一性合成 化學(xué)分析（膽固醇的測(cè)定） 聚合（高聚物合成，環(huán)保材料合