基因工程育種微生物遺傳育種-全文預(yù)覽
【正文】 精提 32 氯化銫梯度離心法： 有效地去除蛋白質(zhì)、 RNA、染色體 DNA、受損質(zhì)粒。 ? 具有多種限制酶的單一切割位點，便于外源DNA的插入，并且插入后不影響載體的復(fù)制 。 12 狹義：來源不同但 識別和切割相同 序列的酶。 6 限制性核酸內(nèi)切酶的類型 特性 Ⅰ 型 Ⅱ 型 Ⅲ 型 功能 限制、修飾 限制 限制、修飾 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 3種不同亞基 單一成分 2種不同亞基 所需輔助因子 ATP, Mg2+, SAM Mg2+ ATP, Mg2+, SAM 識別序列 EcoB: TGA(N)8TGCT 4~8bp,旋轉(zhuǎn)對稱 EcoPI: AGACC 切割位點 距識別位點至少1000kb處隨機切割 在識別序列內(nèi)（或附近） 距識別位點 3’端 24~26bp處 7 限制性核酸內(nèi)切酶的命名 用產(chǎn)生菌的 屬名一個字母 (大寫， 斜體 )＋種名兩個字母 (小寫， 斜體 )[＋ 菌株名一個字母 ]＋ 編號 （ 羅馬數(shù)字 ） [例 ] EcoRI, EcoRII：從 Rye13菌株中獲得 HindI， HindII， HindIII：從 Haemophilus influenzae d菌株獲得 8 Ⅱ 型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特征 （ 1）識別序列： 一般 4~8bp，具有二重旋轉(zhuǎn)對稱軸，序列呈回文結(jié)構(gòu) ( palindromic structure ) 例： AluI： 5’AGCT3’ AsuI： 5’GGNCC3’ PstI： 5’CTGCAG3’ 9 （ 2） 切割： 產(chǎn)生平末端： SmaI 5’CCC↓GGG3’ 3’GGG↑CCC5’ 產(chǎn)生 3’OH單鏈粘性末端 : PstI 5’C TGCA ↓ G 3’ 3’G ↑ ACGT C5’ 產(chǎn)生 5’P單鏈粘性末端 : EcoRI 5’G↓AATT C 3’ 3’C TTAA ↑G5’ 10 11 酶剪切條件 ? 需要鎂離子的存在，特定的酸堿度和離子強度。1 第五章 基因工程育種 Geic engineering 基因工程是將不同生物的基因在體外人工剪切組合，并和載體（質(zhì)粒、噬菌體、病毒） DNA連接，然后轉(zhuǎn)入微生物或細(xì)胞內(nèi)，進行擴增，并使轉(zhuǎn)入的基因在細(xì)胞內(nèi)表達，產(chǎn)生所需要的蛋白質(zhì)。 核糖核酸酶 (RNase)與脫氧核糖核酸酶 (DNase) 核酸外切酶： exonuclease 核酸內(nèi)切酶： endonuclease 5 寄主控制的限制與修飾作用 （ 1）寄主控制的限制作用 (Restriction) 作用：破壞外源 DNA，使之迅速降解 機制：限制性核酸內(nèi)切酶，識別特定的堿基序列并進 行切割 （ 2）寄主控制的修飾作用 (Modification) 作用：保護自身的 DNA，使之不受限制 機制：甲基化酶，催化 S腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到 限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。 ? 其它：甘油濃度等可以改變對序列的識別。 體外 DNA連接 ? 連接具有互補粘性末端的 DNA片段 ? 連接具有平末端的 DNA片段 ? 先在 DNA片段末端加上人工接頭，使其形成粘性末端，再行連接 15 連接用酶 （ 1） T4 DNA連接酶： ? 催化反應(yīng)需要 Mg+2, ATP ? 催化粘性末端連接，效率較高 ? 催化平末端連接 （
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