【正文】 預(yù)期結(jié)果或成果 預(yù)期通過對(duì)不同年齡段的非癡呆人群 腦脊液 Tau 蛋白和 Aβ的檢測(cè)，界定其人群的參考正常值。 4 3．本課題的特色和創(chuàng)新之處及立論根據(jù)（與 國(guó)內(nèi)外類似研究比較） 腦脊液是存在于腦室及蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)的一種無色透明液體，腦細(xì)胞的代謝產(chǎn)物可釋放到腦脊液中，腦脊液中成分的變化一定程度反應(yīng)了腦細(xì)胞的活動(dòng)情況。47(10):177681. 3 2．研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo)和擬解決的關(guān)鍵問題 研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo)： 本研究擬通過對(duì)不同年齡段非 AD 和 AD 病人腦脊液中 Aβ Aβ 42和 Tau 蛋白的檢測(cè)，確定 腦脊液中 Aβ Aβ 42和 Tau 蛋白的參考正常值。 4． Kanai M,Matsubara E,Isoe K,et study of cerebraospinal fluid levels of tau, Aβ 140,Aβ 142(43) in Alzheimer’s disease:A stady in Japan,Ann Neurology,1998,44:1726. 5． 王琨，丁新生，程虹。中華老年醫(yī)學(xué)雜志， 1999， 1： 1315。腦脊液中 β 淀粉樣蛋白檢測(cè)對(duì)老年期癡呆的診斷意義。由此推斷： 腦脊液 Tau 蛋白和 Aβ聯(lián)合測(cè)定可能會(huì)提高實(shí)驗(yàn)室診斷 AD 的應(yīng)用價(jià)值。 AD 的基本病理變化是老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)，前者的主要成分是 β 淀粉樣蛋白（ Aβ ） ，后者的主要 成分是 Tau 蛋白 。 腦脊液中 β 淀粉樣蛋白（β Amyloid Protein, β AP， Aβ）是淀粉樣前體蛋白（ APP）在分泌酶的作用下裂解出來的含有 4043 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)， 腦脊液中 Aβ有 Aβ 40和 Aβ 42兩種形式；兩者在正常老年人和Alzheimer 病（ AD） 腦脊液中 均存在， Aβ 42與 AD 老年斑形成密切相關(guān)。正常腦細(xì)胞內(nèi) Tau 蛋白磷酸化位點(diǎn)很少，因而不易被磷酸化，腦 脊液中 Tau蛋白的含量較少。 6}、已具備 激光捕獲顯微分離技術(shù)和設(shè)備。 （二）研究基礎(chǔ)與工作條件 工作條件 1）、配有相應(yīng)的種植儀器和種植材料，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)成熟 , 加力裝置已具備。 4）、探尋新的未知的與骨形成或骨破壞密切相關(guān)的基因，為進(jìn)一步的深入研究提供新的線索。 預(yù)期研究成果 成果以論文形式發(fā)表并組織鑒定。 完成研究方法技術(shù)路線中的第二部分，即體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞在間斷力學(xué)刺激下基因表達(dá)譜的基因芯片分析。 B）、若體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的特異性基因表達(dá)是體外細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)中沒有出現(xiàn)的，則很有可能是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞耦聯(lián)的作用方式，可為進(jìn)一步研究?jī)烧呦嗷プ饔梅绞教峁?shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 2）首次應(yīng)用基因芯片技術(shù)從整個(gè)基因組的宏觀水平，探尋不同負(fù)荷狀態(tài)下，骨形成和骨破壞的基因調(diào)控機(jī)制，以及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在其中的作用，及其可能的耦聯(lián)機(jī)制。 與課題相關(guān)的基因芯片檢測(cè)技術(shù)比較成熟，課題組成員有一定的工作經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)，已同生物科技有限公司，生物芯片有限公司達(dá)成協(xié)議，基因芯片的制備和相關(guān)技術(shù)支持可以得到保證。反之亦然。 骨界面 OB、 OC 基因表達(dá)譜的時(shí)序變化 骨界面 OB、 OC 基因表達(dá)譜的時(shí)序變化 研究骨形成到骨吸收質(zhì)的變化過程中， OB、 OC 基因調(diào)控機(jī)理。 2）、據(jù)基因芯片檢測(cè)的結(jié)果，對(duì) I、 II 組基因表達(dá)差異最大的數(shù)個(gè)基因通過逆轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈反應(yīng)（ RTPCR）法，抽提細(xì)胞的總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄，再通過隨機(jī)引物法對(duì)此類基因進(jìn)行基因表達(dá)水平的半定量分析。 3）、 II 組：按“超”負(fù)荷力值加載后，隨機(jī)選 5 只大鼠，分成 6 小組，分別在1h 加載后，以及 24h， 48h,6d 加載（ 每天 3 次，每次 1 小時(shí)）后 取下大鼠股骨，其余方法同 I 組。 3）、將“生理”負(fù)荷和“超”負(fù)荷作用于成骨細(xì)胞，以 1h ,24h ， 48 h， 4d 為取樣點(diǎn)，未加力為對(duì)照，抽提 mRNA 后，逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 cDNA ，應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)成骨細(xì)胞基因表達(dá)譜的時(shí)序變化。 3）、 3 周后取材， 通過骨形態(tài)學(xué)計(jì)量方法分別檢測(cè)各種植體周圍骨質(zhì)的骨小梁表面成骨細(xì)胞數(shù)、骨小梁表面破骨細(xì)胞數(shù)、有成骨細(xì)胞被覆的類骨質(zhì)表面占骨小梁總表面的百分比、骨小梁吸收表面占骨小梁總表面的百分比等相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。 擬采取的研究方案及可行性分析。 2）、通過體內(nèi)體外 OB 和 OC，在間斷力學(xué)刺激下 不同時(shí)間點(diǎn)取樣的基因表達(dá)譜的比較，研究骨系細(xì)胞基因表達(dá)的時(shí)序變化。 第四部分：采用 RTPCR 方法，對(duì)骨形成和骨破壞過程中 OB、 OC 基因表達(dá)變化差異最 大的幾個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)和驗(yàn)證。313(1):1049. 項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo) ,以及擬解決的關(guān)鍵問題。 285: 10281033. 1 Li L, Chen M, Deng L, Mao Y, et effect of mechanical stimulation on the expression of alpha 2, beta 1, beta 3 integrins and the proliferation, synthetic function in Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. 20xx Jun。 67A(4): 126975. 11 、 Di Palma F, Douet M, Boachon C, et al. Physiological strains induce differentiation in human osteoblasts cultured on orthopaedic biomaterial. Biomaterials. 20xx Aug。22(6:)637. Peake MA, El Haj characterisation of mechanoresponsive regions of the cfos promoter in bone Lett. 20xx Feb 27。 綜上所述，骨作為一個(gè)自適應(yīng)的生物系統(tǒng)是通過多層面、多因素的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控來完成應(yīng)力作用下的骨改建，顯然以往只針對(duì)其中某一層面、若干因素的單一視角的研究，難以系統(tǒng)透徹地闡述應(yīng)力作用下骨形成和骨吸收的基因調(diào)控機(jī)制。 然而，骨組織是不同細(xì)胞群體相互作用的三維空間結(jié)構(gòu)，通過磨碎活組織所提取的 DNA、 RNA 不能代表特定生理或病理過程中單一同類細(xì)胞的信息。（ 3） 由于各學(xué)者多采用體外實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)條件 不盡相同，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性較差，有關(guān)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的報(bào)道，特別是 力學(xué)刺激對(duì)人工種植體 骨界面骨系細(xì)胞基因表達(dá)影響的報(bào)道也極為罕見。有研究表明 [1415]：作為細(xì)胞表面重要受體的整合素，通過識(shí)別某些胞外基質(zhì)蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附反應(yīng)并接受、轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)信號(hào)，并有可能是力學(xué)信號(hào)傳遞的通道。 對(duì)力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究表明 [1214]：骨系細(xì)胞表面的離子通道在細(xì)胞膜受到力學(xué)作用數(shù)秒或數(shù)分鐘后即可引起 G 蛋白活化、第二信使釋放、蛋白質(zhì)磷酸化、生長(zhǎng)因子的分泌、細(xì)胞骨架的變化、細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)粘附的重 建，最終導(dǎo)致基因表達(dá)的變化。 破骨細(xì)胞是骨吸收的主要功能細(xì)胞，傳統(tǒng)認(rèn)為破骨細(xì)胞是一個(gè)“惰性細(xì)胞”，對(duì)力學(xué)刺激不敏感，主要是通過成骨細(xì)胞感受力學(xué)刺激以后，通過耦聯(lián)機(jī)制影響破骨細(xì)胞的活性、增殖和遷移。 Ikegame 等 [6]發(fā)現(xiàn)：加載 6h 后，骨形成蛋白 4（ BMP4）基因表達(dá)增加，成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子 cbfa1/Osf2 也隨著 BMP4 基因表達(dá)開始表達(dá)。 機(jī)械刺激產(chǎn)生的耦合力傳遞到骨組織，使骨系細(xì)胞發(fā)生應(yīng)力應(yīng)變作用，這些變化通過多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致骨系細(xì)胞產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)并完成骨的 改建。理想的人工種 植體或裝置應(yīng)以與骨組織緊密結(jié)合 (骨整合 Osseointegration)的形式行使其生理功能 , 然而，仍有部分植入體不能達(dá)到或保持長(zhǎng)期的骨整合，導(dǎo)致植入體松動(dòng)、脫落和并發(fā)癥的產(chǎn)生，除了植入體材料本身的因素之外，負(fù)荷后骨組織的應(yīng)力變化也是重要的影響因素之一，且已引起眾多學(xué)者的關(guān)注。力學(xué)刺激對(duì)植體 骨界面骨系細(xì)胞 mRNA 表達(dá)的影響 Effects of the mRNA expression in implantbone interface bone cells after mechanical stimulate 摘要 在建立力學(xué)刺激骨系細(xì)胞的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷幕A(chǔ)上，利用激光捕獲顯微分離技術(shù)（ LCM） , 獲取動(dòng)物模型體內(nèi)種植體 — 骨界面區(qū)域的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞 ,用基因芯片法檢測(cè)不同力值的間斷力學(xué)刺激作用下基因表達(dá)譜的時(shí)序變化。 隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，一些人工種植體或裝置越來越多的被植入骨組織，用于治療病變和修復(fù)缺損，如人工關(guān)節(jié)、牙種植體，以及骨內(nèi)固定裝置等。因此，了解力學(xué)刺激對(duì)骨組織與人工材料界面骨改建的影響，將有助于解釋臨床觀察到的現(xiàn)象，有助于與骨生物力學(xué)相關(guān)的諸學(xué)科的發(fā)展，如骨折固定、人工關(guān)節(jié)置換、牽張成骨、口腔種植修復(fù)、口腔正畸、骨質(zhì)疏松癥的防治及骨組織工程研究等等。目前的研究證據(jù)表明： 體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞加載研究證明 [35]：成骨細(xì)胞未受力時(shí) , 早期即刻基因 cfos、cjun 在細(xì)胞靜止期內(nèi)不表達(dá)；受 力學(xué)刺激后初期即明顯增加，其表達(dá)一般與細(xì)胞的增殖分化同時(shí)出現(xiàn)，