【正文】 貌好，且分布均勻。結(jié)果與納米粒度儀測(cè)得的平均粒徑大約相符。表28 交聯(lián)劑濃度對(duì)納米粒子粒徑的影響Table 28Effect of G’s concentration on nanoparticles39。戊二醛結(jié)構(gòu)中存在著兩個(gè)活潑的醛基，有很高的反應(yīng)活性，易與殼聚糖分子中的自由氨基反應(yīng)，形成交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。也可能是由于隨著交聯(lián)劑體積的增加，交聯(lián)得到的殼聚糖納米粒子結(jié)構(gòu)松散，粒徑分布不均勻，在洗滌過(guò)程中，大的粒子聚集沉淀被洗去，剩下粒徑比較小的殼聚糖納米粒子，因此殼聚糖納米粒子的粒徑與交聯(lián)劑的體積無(wú)關(guān)。因此，通過(guò)TEM圖表明，當(dāng)殼聚糖溶液濃度為15 mg/mL時(shí)，制備得到的殼聚糖納米粒子粒徑小，形貌好，且分布均勻。結(jié)果與納米粒度儀測(cè)得的平均粒徑大約相符。表26殼聚糖濃度對(duì)納米粒子粒徑的影響Table 26Effect of CS concentration on nanoparticles39。這可能是由于殼聚糖溶液濃度過(guò)低，水相液滴中所含的殼聚糖量極少，乳化分散后與交聯(lián)劑交聯(lián)得到的粒子結(jié)構(gòu)松散，不致密，因此粒徑較大。綜上，span80用量為油相體積的3%時(shí)，殼聚糖納米粒子的粒徑最小，形貌較好，且分布均勻。結(jié)果與納米粒度儀測(cè)得的平均粒徑大約相符。表25 Span80用量對(duì)納米粒子的影響Table 25Effect of Span80 dosage on nanoparticles39。乳化劑的加入，可以在油水界面上形成一層界面膜，降低乳滴的表面能，減少納米粒子粘連的幾率。 不同油相比納米粒子的TEM圖Fig. TEM images of nanoparticles39。從TEM圖中可觀察到，當(dāng)油水比較小時(shí)，得到的粒徑較小，但是形貌不規(guī)則。 sizesNo.O/W(V/V)Paraffin(ml)Size()PdIA110:15 A220:110 A330:115 A440:120 A550:125 油水比對(duì)納米粒子的影響Fig. Comparison of different ratio of paraffin to CS on nanoparticles39。從表跟圖中可以看出，粒子粒徑在油相體積較小時(shí)粒徑隨油相體積增加而增加，當(dāng)油相體積增加到一定量時(shí)，則隨著油相體積的增加而減少。（CSNPs）。油相：量取液體石蠟25 mL，加入占其體積3% ( g)的Span80,攪拌均勻后備用。油相：量取液體石蠟25 mL，加入占其體積3%( g)的Span80,攪拌均勻后備用。油相：量取液體石蠟25 mL，加入占其體積2%，3%，4%，5%，6%的Span80，攪拌均勻后備用。油相：分別量取液體石蠟5 mL，10 mL，15 mL，20 mL，25 mL，加入占其體積5%的Span80,攪拌均勻后備用。油相：分別選用液體石蠟，甲苯各25 mL，加入占其體積5%( g)的Span80,攪拌均勻后備用。取500 μL CS溶液緩慢滴加到含有表面活性劑span80的的液體石蠟中，經(jīng)超聲處理后形成穩(wěn)定的W/O型微乳液，然后滴加一定量的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌3 h，離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液（CSNPs）。(2) 透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡（Transmission electron microscope，TEM），型號(hào)TEANAI10型透射電子顯微鏡philips，或高分辨透射電子顯微鏡（High resolution transmission electron microscope，HRTEM)，它是把經(jīng)加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產(chǎn)生立體角散射。但是很多研究證明對(duì)于粒徑小于1 μm的顆粒，必須用Mie散射理論求解粒徑分布。測(cè)量溫度( 177。第二章 空白殼聚糖納米粒子的制備 實(shí)驗(yàn)部分 材料與試劑表21實(shí)驗(yàn)試劑Table 21 Reagents used in experiment試劑名稱規(guī)格產(chǎn)地液體石蠟AR天津市化學(xué)試劑公司Span80CP天津市化學(xué)試劑公司殼聚糖90 % MW=60000上海伯奧生物科技有限公司戊二醛(25%)AR天津市百世化工有限公司甲苯AR天津市百世化工有限公司無(wú)水乙醇AR天津市百世化工有限公司石油醚AR天津市百世化工有限公司冰醋酸AR天津市百世化工有限公司實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水，藥品稱量均使用德國(guó)Sartorius 公司的電子分析天平，誤差為177。但是研究表明，SeC不易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的滲透性不強(qiáng)。 課題的研究意義與創(chuàng)新點(diǎn) 課題的研究意義惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命的疾病。(6)提高藥物的穩(wěn)定性隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因重組肽和蛋白質(zhì)藥物不斷涌現(xiàn)，應(yīng)用于臨床的種類也越來(lái)越多。(5)提高疏水性藥物對(duì)細(xì)胞膜的通透性，增強(qiáng)細(xì)胞吸收殼聚糖納米粒子溶脹引起的擴(kuò)散釋藥過(guò)程可以增加藥物在吸收部位的濃度梯度，對(duì)藥物的吸收具有協(xié)同促進(jìn)作用。(3)增加藥物的靶向性殼聚糖本身具有一定的黏膜黏附性，通過(guò)控制殼聚糖納米粒子的大小，形狀，選擇適當(dāng)?shù)慕o藥方法，能夠提高殼聚糖納米粒子的靶向效果。Jaganathan等[37]采用乳化交聯(lián)法制備了載有破傷風(fēng)類毒素的殼聚糖納米粒子，穩(wěn)定劑海藻糖能夠保持抗原蛋白質(zhì)的活性，納米粒子的包封率也從加入海藻糖前的40%提高到90%。它的應(yīng)用主要有以下幾方面：(1)作為藥物載體，可包埋多種類型藥物殼聚糖納米粒子由于其良好的生物相容性，生物降解性和低細(xì)胞毒性，被廣泛應(yīng)用于藥物載體方面。目前最常用的方法是將殼聚糖醋酸溶液加入含表面活性劑的液體石蠟中，形成W/O型乳劑，升溫再減壓干燥除去溶劑，分離得到殼聚糖納米粒子。另一種操作方法為：在殼聚糖溶液中加入表面活性劑，然后再逐滴加入硫酸鈉溶液，攪拌或超聲30分鐘后，離心分離出產(chǎn)物。先將殼聚糖與α氨基NCA（Ncarboxyanhydride）接枝共聚，再將一定量L亮氨酸NCA分散至乙酸乙酯中，并用Span80乳化后與水溶性殼聚糖在一定條件下反應(yīng)2 h，經(jīng)進(jìn)一步處理可得殼聚糖空心納米粒子[32]。通過(guò)限制溶質(zhì)沉降次數(shù)可控制空心納米粒子的球殼厚度，除去納米粒子中的核物質(zhì)即可獲得所需的空心結(jié)構(gòu)。納米粒子的粒徑取決于噴嘴的直徑，噴嘴流率，霧化壓力，入口溫度和交聯(lián)程度等因素[32]。沈宏亮等[34]利用乳化交聯(lián)法制備了左氧氟沙星羧甲基殼聚糖納米粒子，并對(duì)殼聚糖納米粒子的體外釋藥性能進(jìn)行了深入的研究。制備殼聚糖納米粒子的方法有多種[32]，其選擇的依據(jù)受以下因素影響：①目標(biāo)粒徑分布；②有效成分的熱化學(xué)性質(zhì)與穩(wěn)定性；③有效成分的釋藥動(dòng)力學(xué)與重現(xiàn)性；④載藥納米粒子的穩(wěn)定性與毒性溶劑殘留。 殼聚糖納米粒子的制備殼聚糖緩釋體系主要分為：殼聚糖納米粒子，殼聚糖微球，殼聚糖緩釋片，殼聚糖緩釋膜，殼聚糖緩釋凝膠5種類型[26]。由于氨基的存在，它是自然界中唯一帶正電荷的堿性多糖。 殼聚糖納米粒子在納米藥物載體領(lǐng)域的制備和應(yīng)用 殼聚糖的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)殼聚糖也稱為甲殼胺或幾丁聚糖殼聚糖，是一種天然的生物高分子線性多氨基多糖，為甲殼素的脫乙酰化產(chǎn)物。近年來(lái)，生物大分子材料由于其可再生性，無(wú)毒性以及良好的生物相容性，生物可降解性和黏膜粘附性等優(yōu)點(diǎn)成為藥物載體研究的熱點(diǎn)，于是利用生物大分子材料來(lái)制備納米藥物載體的研究應(yīng)運(yùn)而生。 納米藥物載體的類型目前，用于納米藥物載體研究的生物可降解聚合物主要有合成聚合物和天然高分子聚合物。 納米藥物載體的研究進(jìn)展理想的納米粒載體應(yīng)是無(wú)毒和可生物 的。納米技術(shù)與材料已經(jīng)在航天，汽車，消費(fèi)日用品，生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得應(yīng)用，并取得一些列舉世矚目的成果[19]。 nm內(nèi)的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)的構(gòu)造技術(shù)，即納米級(jí)材料的設(shè)計(jì)，制造，測(cè)量和控制技術(shù)[17]。因此，希望借助納米藥物載體來(lái)提高細(xì)胞吸收，減少它進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的時(shí)間。因此，SeC具有更廣譜高效的抗腫瘤活性，且對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小。硒代胱氨酸是胱氨酸分子中S被Se所取代后的含硒氨基酸[14]。其中含硒氨基酸硒代半胱氨酸（selenocysteine）是生物合成和摻入到蛋白質(zhì)分子中的第21種氨基酸[12]。有機(jī)硒主要包括硒多糖，含硒蛋白質(zhì)，烷基硒，甲基硒酸以及人工合成的具有生物活性的有機(jī)硒化合物。 硒具有抗氧化作用，它是谷胱甘肽過(guò)氧化酶（GSHPx）的活性中心，常以硒代半胱氨酸形式存在，GSHPx能減輕或阻斷自由基所致的脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)，保護(hù)蛋白質(zhì)、清除自由基和DNA及生物膜的完整性，修復(fù)損傷分子部位；同時(shí)能提高機(jī)體免疫能力，抵抗疾病[9]。1988年，我國(guó)已經(jīng)把硒列為膳食營(yíng)養(yǎng)素之一。1957年美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)家Schwarz和Foltz首次用硒治療動(dòng)物肝壞死取得成功后，硒逐漸明確為動(dòng)物體內(nèi)必需的微量元素[2] 。 Selenocystine。本文以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，液體石蠟為乳化體系，制備出粒徑小，分散性好，載藥率及包封率較高的SeC殼聚糖納米粒子。暨南大學(xué)本科生畢業(yè)論文殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其體外抗腫瘤活性的研究摘 要硒代胱氨酸(SeC)是一種天然的含硒氨基酸，研究證明，SeC作為一種新型高效的抗腫瘤藥物在腫瘤化學(xué)預(yù)防與治療中發(fā)揮著重要的作用。殼聚糖(CS)是一種優(yōu)良的天然藥物載體，具有良好的生物相容性，生物可降解性和無(wú)毒性,被廣泛地用作醫(yī)藥載體。 crosslinking emulsification。但由于毒性，硒曾被認(rèn)為是一種對(duì)高級(jí)生物有害的元素。此后，硒與硒化合物的生理作用受到普遍關(guān)注。微量元素硒具有防癌，抗癌，抗氧化，拮抗重金屬，抗逆境等多種生物學(xué)活性[8] 。無(wú)機(jī)硒主要包括硒，硒酸鹽(亞硒酸鈉,亞硒酸鋅等)，氧化硒，硫化硒，氯化硒以及硒化物（硒化氫，硒化鈉，硒化鉀等）等。而相比之下，有機(jī)硒化合物吸收率高，生物活性強(qiáng)，毒性低和環(huán)境污染小，不僅能夠更好地發(fā)揮硒的作用，而且在激發(fā)免疫反應(yīng)上也比無(wú)機(jī)硒顯著，抗癌作用更強(qiáng)[11]。在哺乳動(dòng)物組中，硒代氨基酸是硒的主要存在形式，包括硒代胱氨酸(SeCys) 和硒代蛋氨酸(SeMet)。且SeC對(duì)人類正常纖維原細(xì)胞Hs68的細(xì)胞毒性很小，IC50400 μΜ，毒性遠(yuǎn)小于亞硒酸鹽。 μΜ，說(shuō)明SeC不易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的滲透性不強(qiáng)。納米，是尺寸度量單位，1納米=109 米，相當(dāng)于4個(gè)原子并列的直徑。進(jìn)入21世紀(jì)，納米技術(shù)迅速發(fā)展，作為一個(gè)多學(xué)科交叉領(lǐng)域，涉及面廣應(yīng)用十分廣泛。其中，納米藥物載體在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中控釋緩釋的應(yīng)用極為廣泛，提高藥物的利用率療效和減少藥物的副作用已成為醫(yī)藥研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要課題。因此，尋找生物相容性好，低毒性的納米藥物載體成為了近年來(lái)研究的目標(biāo)。但是，通過(guò)化學(xué)方法合成得到的大部分藥物載體在生物相容性，可降解性以及細(xì)胞毒性等方面還存在不盡如意的地方[24]。由于生物大分子可以從自然界的動(dòng)植物中獲得，生物相容性良好，并且可被生物體內(nèi)的酶降解，毒副作用較小，且分子上帶有的羥基，氨基，羧基等大量可反應(yīng)的官能團(tuán)，可作為化學(xué)修飾的位點(diǎn)，因此它們作為藥物載體材料具有廣闊的應(yīng)用前景[25]。 殼聚糖與甲殼素的結(jié)構(gòu)(A) 甲殼素 (B)殼聚糖殼聚糖的每個(gè)C6單元均含有一個(gè)氨基，兩個(gè)自由羥基。曹等[30]通過(guò)研究表明，殼聚糖無(wú)細(xì)胞毒性，不溶血，不致敏，生物相容性良好，可以滿足醫(yī)藥衛(wèi)生及化妝品原料的基本要求。近幾年殼聚糖納米粒子的制備和應(yīng)用成為研究的熱點(diǎn)[31]。此法是將殼聚糖溶液加入含有表面活性劑的油相中形成W/O型乳劑，再加入一定量的交聯(lián)劑如戊二醛，甲醛，三聚磷酸鹽，檸檬酸鹽，硫酸鹽和京尼平等進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)固化，通過(guò)離心純化即可制得殼聚糖納米粒子[33]。此法是將殼聚糖溶于酸性溶液中，再將藥物溶解或分散于該殼聚糖溶液，加入一定量的交聯(lián)劑，在惰性的熱氣流中噴霧干燥，當(dāng)液體通過(guò)蠕動(dòng)泵輸送到噴嘴后，壓縮空氣將液體霧化為小液滴，液滴與熱空氣被共同吹入一個(gè)腔體中，液滴中的酸迅速蒸發(fā)，從而形成殼聚糖含藥納米粒子[33]。納米粒子的球殼是通過(guò)溶質(zhì)逐層沉降制得的。Wang等在溫和的條件下通過(guò)界面聚合法一步制備多糖多肽復(fù)合空心納米粒子。然后用冷熱水交替洗滌提純產(chǎn)物。溶劑蒸發(fā)法又稱液中干燥法，常用的溶劑蒸發(fā)法是根據(jù)聚合物與藥物的性質(zhì)制成乳液體系，形成穩(wěn)定乳液后，采用升溫，減壓抽提或連續(xù)攪拌等方法使有機(jī)溶劑擴(kuò)散進(jìn)入連續(xù)相并通過(guò)連續(xù)相和空氣的界面蒸發(fā)，納米粒子固化，并經(jīng)過(guò)處理最終得到載藥納米粒子的過(guò)程[32]。 殼聚糖納米粒子的應(yīng)用殼聚糖納米粒子在腫瘤治療方面應(yīng)用廣泛[33] 。經(jīng)沙鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性增加，能夠黏附在胃黏膜上。Chandy 等[37]制備了殼聚糖包衣的PLA/PLGA納米粒子，用于5氟尿嘧啶的腦膠質(zhì)瘤的靶向治療，研究發(fā)現(xiàn)所得納米粒子表面孔空隙率低，藥物初次突釋后呈典型的二相釋藥，可靶向結(jié)合腦膠質(zhì)瘤，且穩(wěn)定釋放30 d以上。徐海濤等觀察了殼聚糖順鉑緩釋納米粒子對(duì)C6膠質(zhì)瘤大鼠瘤內(nèi)化療的療效，結(jié)果表明，殼聚糖順鉑納米粒子毒性小，安全性較高，療效可靠。Mitra等將Doxorubicin（DXR）包封于殼聚糖納米粒子中，不僅腫瘤實(shí)體內(nèi)藥物濃度提高，作用維持時(shí)間延長(zhǎng)，治療效果改善，不良反應(yīng)也明顯減輕。Alexakis等制備了小牛胸腺DNA海藻酸酯納米粒子，外面包覆殼聚糖制成載藥納米粒子后經(jīng)過(guò)胃腸道時(shí)藥物不被破壞，60%DNA可以從糞便等排泄物中得到。硒代胱氨酸是一種新型高效的抗腫瘤藥物，生物活性高，對(duì)正常細(xì)胞毒性小。 創(chuàng)新點(diǎn)通過(guò)以CSNPs為載體，有效增強(qiáng)SeC的體外抗腫瘤活