【正文】 ： (3)對溶菌酶濃度因素 C 分別計算每種水平所對應的總菌數(shù)平均值： 10mg/ml： K1C =++= 平均 值 ： 30mg/ml： K2C =++= 平均 值 ： 50mg/ml： K3C =++= 平均 值 ： 分別計算各因素不同水平之間的總菌數(shù)的極差，結(jié)果顯示 RA 為 ， RB為 ， RC為 ，由此說明反應所需的溶菌酶濃度 C對總菌數(shù)的影響最大，雜交溫度 A的影響次之，探針濃度 B的影響最小。 8 3 2 1 177。 4 2 1 2 177。 ( 109) 熒光原位 雜交條件的確定 本研究以 EUB338 探針為例 ，在文獻參考的基礎上 針對雜交 條件包括： 溫度、探針濃度以及溶菌酶的濃度設計了 3因素 3水平正交試驗以及 擬水平法正交試驗設計 以求得 熒光原位 雜交 試驗 的最佳 雜交 條件。 ( 1011) 177。 表 31 樣本離心速度對靶細菌計數(shù)結(jié)果的影響 (x 177。 第三章 結(jié)果與分析 樣品離心速度對把細菌計數(shù)的影響 本研究 以 EUB338和 Bif164探針為例 分別采用冷凍低速和冷凍高速對樣品進行離心， 所得結(jié)果如表 2 所示。 圖譜數(shù)據(jù)分析 通過 Quantity One 軟件，將 ERICPCR 圖譜轉(zhuǎn)變?yōu)椴ǚ鍒D， 每個波峰代表一個 ERIC 條帶， 峰下面積代表該條帶亮度即該類群的種群數(shù)量。 DNA 質(zhì)量檢測 糞便微生物總 DNA經(jīng) %（ W/V） 瓊脂糖凝膠電泳 ， Goldview染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測分析。加入等體積的 Tris飽和酚：氯仿：異戊醇（ 25： 24： 1），充分混合后 20200g 離心 8min，取上清；再加入等體積的氯仿：異戊醇（ 24： 1）， 20200g 離心 8min，取上清（重復抽提操作一次）。 樣品的前處理 取 200mg 糞便樣品置于 2ml 離心管中，加入 1mlPBS (pH )，充分均質(zhì)化后 200g 離心 6min，取上清。其中 A、 B、 C、 D分別是 四 個不同的基因組 DNA 模板。 ERICPCR 反應條件的優(yōu)化 在文獻報道的基礎上，本試驗針對腸道微生物總 DNA 進行 ERICPCR 擴增體系（ Mg2+ 、 Taq 酶、引物量）進行了一定的優(yōu)化。 CGMP 對小鼠腸道菌群群落結(jié)構的分析 主要化學試劑 PCR 反應所需的 Buffer、 Taq DNA 聚合酶、 dNTP 等購自 TakaRa 公司 , 所需ERIC 引物（ ERIC1： 5,ATGTAAGCTCCTGGGGAATCAC3, ERIC2： 5,AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG3， ） 由上海生工公司合成 。然后用乙醇梯度（ 50%， 75%， 95%）對細菌進行脫水各 2min，室溫干燥。然后將上述糞便樣品 4℃ 下 700g 離心 2min 以除去糞便中的殘渣部分 。其中對照組每天 早上 灌胃 ， CGMP組每天 早上 灌胃 濃度為 ， 灌胃周期為 2周。 該研究對乳中功能性成分在維持其微生態(tài)平衡，探討腸道中微生物菌群與人類健康的關系以及調(diào)理腸道中微生物菌群的平衡等方面將提供一定的理論依據(jù)，并為其在功能性食品、醫(yī)藥或其它領域的應用方面奠定堅實的理論基礎。近年來，隨著科技的進步人們逐漸認識到腸道微生物對人類健康的重要性。 近年來國外學者大量研究和報道了 CGMP 的相關生理功能（如：雙歧桿菌增殖因子、抑制胃酸分泌、抑制病原體包括病毒和細菌等粘附至細胞、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)應答等），其生物學功能已經(jīng)等到了科學家和相關企業(yè)的關注，將在生物醫(yī)藥、功能食品以及專用食品的研究開發(fā)中為人類健康做出貢獻。像生理學家描述人體普通器官一樣，有學者[50]建議用 ―微生物器官 ‖(microbial an)來描述腸道微生物菌群：他由不同種類但彼此又相互聯(lián)系，并與宿主細胞之間不斷地進行信息交 流的細胞構成；他消耗、存儲和重新分布能量；他生理性地調(diào)控重要化學物質(zhì)轉(zhuǎn)化；他通過自我復制來維持和修復自身。靳連群 [48]等應用基因芯片對涉及 9 個菌屬的 143 株腸道致病菌在相同的條件下進行了雜交檢測，得到菌屬 (科 )特異性的雜交圖譜，從而達到對細菌進行檢測鑒定的目的。 大量的研究表明以 ERICPCR指紋圖譜技術為基礎的一系列分子生物學方法是研究復雜環(huán)境微生物群落的組成、結(jié)構與功能關系的一種有效方法。 1999年， DiGiovanni 等 [21] 首次將ERICPCR技術 用于混合菌群 的分析中。該序列長約 124～ 127 bp，并且在其中心存在高度保守長約 40 bp的核心序列 ERICPCR技術是利用 ERIC核心的高度保守序列設計引物進行 PCR，因此通過該技術擴增基因組 DNA，構建 DNA指紋圖譜，建立快速檢測的分子分 型平臺，能廣泛用于微生物分類鑒定、環(huán)境微生物動態(tài)分析等方面的研究 [46]。由某一限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的片段大小和數(shù)目在不同個體中即表現(xiàn)出差異。目前技術 作為一個極有效的實驗方法已被廣泛地應用于微生物生態(tài)學研究中。R. Bibiloni[40]等應用 PCRDGGE 技術對結(jié)腸炎小鼠的大腸微生物區(qū)系進行了分析，證實了 PCRDGGE 可以有效地檢測腸道中微生物組成的變化。分子的形狀主要是由其一級結(jié)構（即序列組成）決定的，堿基之間的氫鍵是維持二級結(jié)構的主要作用力，這種作用力對溫度或化學變性劑敏感，當溫度或化學變性劑升高到一定值，就會破壞氫鍵，使 DNA 雙鏈部分打開。近幾年來人們已經(jīng)證實將熒光原位雜交技術與流式細胞儀結(jié)合起來是一項很有用的技術。因此根據(jù)待測微生物 16S rRNA片段中的保守序列，設計相應的寡核苷酸探針就可以實現(xiàn)對靶微生物的檢測。 1988年 , Giovannoni 等 [11]首次將熒光原位雜交技術（ fluorescence in situ hybridization， FISH)引入細菌學研究中 , 使用放射性標記 rRNA 寡核苷酸探針檢測微生物。 目前大多數(shù) 微生物分子生態(tài)學技術都是依賴于 16S rRNA 基因序列 的 高度保守 性， 其核苷酸位點的變化具有種的特異性。 表 11 傳統(tǒng)培養(yǎng)微生物方法的優(yōu)缺點 優(yōu)點 缺點 廉價 費時費力 應用范圍廣 樣品要求立即處理 可以達 到細菌數(shù)目定量 嚴格厭氧菌要求專業(yè)的技術和設備 由專業(yè)的微生物學家操作，可以得到復雜的生態(tài)學的表征 一旦培養(yǎng)的細菌分離出來后，需要很多技術進行鑒定 可以進行生理學研究 選擇性培養(yǎng)基的選擇會影響試驗結(jié)果 可以進行生化研究 只能檢測到可培養(yǎng)的微生物 分子生物學技術 近年來隨著分子生物學、基因組學和生物信息學等新興學科的發(fā)展及其向微生物學領域的滲透，逐漸形成了一個新的交叉學科分支 ——微生物分子生態(tài)學(Molecular Microbial Ecology)。 雖然在過去近半個世紀里傳統(tǒng)培養(yǎng)技術取得了重大進展 , 如厭氧培養(yǎng)技術的發(fā)明 , 動物模型的建立以及無菌動物的應用等， 但是 環(huán)境中可培養(yǎng)的微生物只是占到很小的比例，如： 海洋中可培養(yǎng)的微生物只占總數(shù)的 %[4]，湖水中可培養(yǎng)的微生物占總數(shù)的 %[5]，活性污泥中叫 ?培養(yǎng)的微生物占總數(shù)的 115% [6， 7]，土壤中傳統(tǒng)培養(yǎng)技術僅能分離 1%10%的微生物 [8]。哺乳動物細胞表達一系列的 tolllike受體，用以識別細菌的保守型亞基（高等真核生物力沒有發(fā)現(xiàn)） [35]，同時產(chǎn)生不同類型的細胞因子應答，這被以信號的形式傳遞到潛在組織進行免疫應答。 因此 , 腸道微生物在腸道發(fā)育和成熟過程中發(fā)揮重要的作用 , 是腸道建立起正常的免疫功能所必需的。腸道內(nèi)微生物定植會影響腸系淋巴組織的組成。越來越多的證據(jù)表明腸黏膜免疫功能與寄居在腸道中為數(shù)眾多的腸道菌群 (intestinal flora)有密切關系 [31]。 微生物在維生素 k 的合成，鈣離子、鎂離子、鐵離子的吸收過程中也起到了重要作用。 腸道內(nèi)微生物對未消化的碳水化合物（主要有 抗性淀粉，纖維素，半纖維素，膠質(zhì)和樹膠 ）、蛋白質(zhì)（主要有 膠原質(zhì)，胰腺酶，脫落的上皮細胞和被溶解的細菌 ）和肽進行代謝，其代謝的終點是短鏈脂肪酸 [34]。另外，這些腸道內(nèi)的正常菌群還能夠通過產(chǎn)生抗菌的細菌素來抑制競爭菌的生長，這種合成細菌素的能力廣泛地分布在胃腸道的微生物群系中，但同時寄主能夠控制這種細菌素的產(chǎn)生，因為這些物質(zhì)中大多數(shù)是可以被蛋白酶降解的蛋白質(zhì)復合體，因此，這些細菌素的作用可以被寄主通 過位置效應來限制的，避免微生物在機體內(nèi)產(chǎn)生過多的毒素。 保護功能：屏障作用 體內(nèi)正常微生物在腸粘膜上形成一層菌膜以抵御外來微生物的定植，因此對防止組織受到病原菌侵染方面起到很重要的作用。一般情況下，腸道菌群與人體外部環(huán)境保持著一個平衡狀態(tài)，對人體的健康起著重要作用，但是這種平衡在某些情況下可能被打破，造成人體腸道菌群失調(diào)，從而引起 多種疾病，如：炎性腸?。?IBD）、結(jié)腸癌、類風濕性關節(jié)炎、遺傳過敏性皮炎、哮喘等 [29,31,32]。 近年來，將分子生物學的方法應用到腸道微生物檢測發(fā)現(xiàn)：一些兼性厭氧菌包括大腸桿菌、腸球菌（ enterococci）和乳酸桿菌，在人體的盲腸中達到非常高的密度和代謝活性，因為盲腸內(nèi)容物中總細菌 rRNA 的 50%都與這些菌種的一致，而糞便樣品中這些菌種 rRNA 的數(shù)量僅達到 7% 。 腸道微生物的分布 胃腸道上段 (胃及小腸 )微生物含量較少，僅有少量黏附在上皮的細菌以及其它一些過路菌。胎兒的出生方式（自然生產(chǎn)和剖腹生產(chǎn)），嬰兒喂養(yǎng)方式（母乳喂養(yǎng)和非母乳喂養(yǎng)）甚至嬰兒出生的環(huán)境（發(fā)達國家和發(fā)展中國家，甚至出生的醫(yī)院） 等 都會影響嬰兒體內(nèi)正常 菌群的構建。其中許多微生物對人體健康起到了重要作用，他們可以協(xié)助機體的消化、吸收，對外來的病原微生物產(chǎn)生免疫應答等[27]，而同時還有一些微生物則可能導致人體疾病：結(jié)腸炎、類風濕性關節(jié)炎等。 CGMP 具有獨特的氨基酸組成，特別是幾乎不含有芳香族氨基酸，因此可作為苯丙酮尿癥患者膳食中首選的成分 [19]； CGMP 含有較多的支鏈氨基酸 (如 Val和 Ile) ，可用于多種肝病的治療 [20]；最近一些研究表明，由 CGMP 再降解所得的一些小肽有抑制血小板凝集及降低血壓效果 [21]； CGMP 能夠有效促進鋅的吸收 [22]； CGMP 的糖鏈中 含有較多的氨基葡萄糖，對炎癥性腸疾患者有較好的療效作用；有研究證實在幼年恒河猴的乳汁中加入 CGMP 可以促進 Ca、 P、 Fe的吸收 [23]； CGMP 含有大量的唾液酸，動物體內(nèi)試驗表明外源唾液酸的攝入能夠顯著增加腦中神經(jīng)節(jié)苷脂的數(shù)量，提高學習能力 [24]；在新生動物中還能顯著地抑制 IgG 的產(chǎn)生，有助于下調(diào)機體對抗原產(chǎn)生的免疫應答，有效預防過敏反應的發(fā)生 [25]。 . 調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng) CGMP 能夠抑制引起脾細胞增殖的促細胞分裂素的產(chǎn)生。 Gyy[14]首先發(fā)現(xiàn) CGMP 是人初乳和常乳中雙歧桿菌的生長促進因子。被注射 CGMP 的老鼠也有同樣的反應。多項研究結(jié)果表明 CGMP 能夠有效 阻止齲齒、病原菌 Streptococcus mutans， S. sanguis， S. sobrinus 在口腔表面的黏附 [9， 10]，并且能夠調(diào)節(jié)牙齒菌斑的微生物，有助于控制牙齒菌斑上酸類物質(zhì)的形成，減少牙齒上羥基磷灰石分解。 CGMP 的生物學活性 .結(jié)合霍亂毒素和大腸桿菌毒素 霍亂毒素由一個亞單位 A 和五個亞單位 B 組成，其中 B 亞基與細胞表面的寡糖受體結(jié)合以后， A亞基就會激活細胞中的腺苷酸環(huán)化酶，最后導致細胞死亡 [5]。 κ酪蛋白來源的 CGMP的氨基酸序列已清楚 ,它是由從 κ酪蛋白的 N 末端 106 位氨基酸 (Met) 開始至 169 位 C 末端 (Val) 結(jié)束的 64 個殘基構成的。氨基酸組成分析表明， κ 酪蛋白 含有 169個氨基酸殘基，兩個胱氨酸殘基 (兩個， SH基 )，通常含有一個磷酸基，富含脯氨酸、丙氨酸、谷胺酰胺、谷氨酸等，分子量約為 104[1]。 κ 酪蛋白 是酪蛋白的一種，它是酪蛋白中唯一一種含有糖成分的酪蛋白，在牛脫脂乳中含量約占總酪蛋白的 13%，在人乳中占總酪蛋白的 30%。 干酪加工時凝乳酶水解酪蛋白（主要是 κ CN） 的苯丙氨酸 蛋氨酸鍵，生成不溶性的副 κ CN(肽鏈的 1～ 105 部分 )和可溶性的多肽(肽鏈的 106～ 169部分 )兩部分，此多肽含有較多的碳水化合物，稱之為 ―糖巨肽 ‖，酪蛋白來源的糖 巨肽稱為 ―酪蛋白糖巨肽 ‖。在凝乳酶凝集乳酪制造過程產(chǎn)生的乳清中含有大量的 CGMP ,有研究 [4]指出 ,甜乳清中其含量約為 ～ ,估計相當于總?cè)榍宓鞍缀康? 20 %～ 25 %左右。 CGMP 與宿主細胞上的受體蛋白具有相似性， 優(yōu)先與細菌和病毒結(jié)合，從而抑制細菌和病毒的繁殖 [8]。狗被注射了 10~15mg 的 CGMP 后，它分泌的胃液酸性減弱，并且胃和十二指腸的的蠕動減慢了。抑制胃液分泌能夠降低動物胃蛋白的水解作用，這樣可以保護乳中的免疫球蛋白、乳鐵蛋白及溶菌酶等蛋白質(zhì)原封不動地穿過胃，有益于嬰兒以及免疫力低下的人增強免疫力。近年來添加雙歧桿菌的多種微生態(tài)制劑已經(jīng)投放市場，有效地緩解乳糖不耐癥，預防和治療腸炎等疾病。 CMP 可與小鼠單核或巨噬細胞通過多