【正文】 37℃保溫 40min。 20200g 離心 15min， 70%的乙醇洗滌一次，然后 20200g 離心 5min。擴增程序： 94℃預(yù)變性 5 min； 94℃變性 50s， 48℃退火 90S， 72℃延伸 3min，35 個循環(huán)；最后 72℃延伸 9min。應(yīng)用SPSS 軟件對兩組小鼠腸道菌群的生物多樣性指數(shù)進行 Oneway AN0VA 分析。 而離心速度過低時，菌懸液中會有大量的雜質(zhì)殘留，會加大玻片制備的難度，且玻片上得雜質(zhì)嚴(yán)重影響計數(shù)得準(zhǔn)確性。s,n = 6) 探針 150g,2min 300g,2min 600g,2min 800g,2min EUB338 __ 177。 ( 1010) 177。 2 1 2 2 177。 6 2 3 1 177。 表 33 正交試驗方差分析表 方差來源 離差 平方和 自由度 均方 離差 F值 臨界 值 A 2 （ 2,2） =19 （ 2,2） =99 B 2 C 2 總離差 2 總和 8 —— —— —— 由方差分析表看出 三個因素的 F值都小于 （ 2,2） ，可見本實驗三個因素設(shè)計的梯度對實驗結(jié)構(gòu)的影響不是很顯著。 探針濃度 B為 20ng/ul 時 試驗結(jié)果最佳。 表 34 L9（ 3^4）表 因素 水平 A B C 總菌數(shù)（ 1011） 1 1 1 1 177。 5 2 2 3 177。 9 3 3 2 177。 FISH 技術(shù)檢測 CGMP 對小鼠腸道菌群的影響 對照組小鼠 每天 灌胃 生理鹽水， CGMP 組小鼠每天灌胃 濃度為， 灌胃周期為 2周 。SD means177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 （ log CFU/g 濕糞便 ） ；雙歧桿 菌的數(shù)量分別為： 177。 對小鼠灌胃 CGMP 后 ，在不同的時間點 分別 用 Lacb722 探針 和 Bif164 探針 檢測 得 到的腸道內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌的 數(shù)量不斷上升 ， 灌胃 2 周后 其腸道內(nèi)乳酸桿菌的數(shù)量 增加 到 了177。（ log CFU/g 濕糞便 ） 相比， 其數(shù)量 均 增加了一個數(shù)量級以上。 ） %， 雙歧桿菌 占總菌數(shù)的百分比分別為 （ 177。而對小鼠灌胃 CGMP 后 ，在灌胃的前期，乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖作用并不明顯， 小鼠腸道內(nèi) 乳酸桿菌 和雙歧桿菌 所占比例 均 從第 4天開始發(fā)生了明顯的變化 ，呈不斷上升的趨勢 。 CGMP 對小鼠腸道 腸桿菌的影響 01234560 3 6 9 12 15試驗天數(shù)腸桿菌占總菌的百分比對照組CGMP組 圖 34 CGMP 對小鼠腸道 腸桿菌 的影響 從表 35所示數(shù)據(jù)可以看出，在實驗的第 0 天，對照組和 CGMP 組小鼠腸道內(nèi)腸桿菌的數(shù)量分別為： 177。而 CGMP 組在灌胃期間，小鼠腸道內(nèi)腸桿菌的數(shù)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，灌胃 2周后其數(shù)量降低到了 177。 ） %，兩組數(shù)據(jù)相比不存在顯著性差異。 CGMP 對小鼠腸道腸球菌的影響 01234560 3 6 9 12 15試驗天數(shù)腸球菌占總菌的百分比對照組CGMP組 圖 35 CGMP 對小鼠腸道 腸球菌 的影響 從表 35所示數(shù)據(jù)可以看出，在實驗的第 0天，對照組和 CGMP 組小鼠腸道內(nèi)腸 球 菌的數(shù)量分別為： 177。 兩組 數(shù)據(jù)經(jīng) SPSS 分析得 出 P值 均大 于 ，充分說明對小鼠灌胃 CGMP 后其腸道內(nèi)腸 球 菌的數(shù)量與灌胃前相比 并不 存在顯著性差異 。 在 灌胃期間，兩組小鼠腸道內(nèi)腸 球 菌的變化 幅度都不明顯。熒光原位雜交技術(shù)不依賴于培養(yǎng)技術(shù)，可培養(yǎng)與不可培養(yǎng)的微生物均能夠檢測到， Sghir等 [24]早在 2020 年就報道設(shè)計合理的熒光原位雜交探針能夠檢測到糞便中接近90%的微生物。 Mg2+濃度對 ERICPCR 反應(yīng)的影響 圖 37 Mg2+濃度對 ERICPCR 反應(yīng)的影響 *其中 A B C D分別代表 4個不同的 糞便樣品 ； 1 2 3 4分別代表 、 2mM 、 、3mM這 4個水平 從電泳圖譜 37 中 可以看出， 個體 A 當(dāng) Mg2+濃度 梯度為 時，所得到的 ERICPCR 圖譜效果最差，小片段沒有擴增出來 。 當(dāng)濃度梯度為 2mM 、 時擴增效果相差不大， 且效果最好， Mg2+濃度 梯度為 3mM 時，有個別片段沒有擴增，且 清晰度不夠。 因此，綜合上述試驗結(jié)果 ，個體 D 的 PCR 擴增體系中 Mg2+最適濃度為 和 3mM。 綜上所述， 當(dāng) PCR 反應(yīng)體系中 Taq。 Taq 酶濃度對 ERICPCR 反應(yīng)的影響 圖 38 Taq 酶濃度對 ERICPCR 反應(yīng)的影響 *其中 A B C D分別代表 4個不同的 糞便樣品 ； 1 2 3 4分別代表 、 、 、5U這 4個水平 從 4 個糞便樣品的 電泳圖譜 38 可以看出， Taq 酶濃度過較小時， PCR 效果最差 ，圖譜條帶豐度較小， 大部分片段集中在 400bp900bp 之間， 只能擴增出腸道中的 優(yōu)勢 菌群 ； 當(dāng) PCR 反應(yīng)體系中 Taq 酶濃度 梯度 為 、 5U時 ，圖譜條帶豐度較大， 條帶清晰，擴增 效果 較為 理想， 且 三個濃度梯度下的ERICPCR 圖譜效果相當(dāng)。 個體 D 當(dāng) Mg2+濃度 梯度為 mM、 2mM 時，所得到的 ERICPCR 圖譜效果較 差， 尤其是小片段的擴增效果很不理想。因此，綜合 上述試驗結(jié)果，個體 A 的 PCR 擴增體系中 Mg2+最適濃度為 和 3mM。但是 FISH 技術(shù)不能得到微生物形態(tài)生化等方面的信息，因此在進行微生物群落研究時結(jié)合傳統(tǒng)的培養(yǎng)、 鏡檢等方法及現(xiàn)代分子生物學(xué)的多種方法，可為環(huán)境微生物群落研究提供更多的信息。 FISH 技術(shù)與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的比較 兩種方法所得到的數(shù)據(jù)如 所示， Lactobacillus4681012140 4 7 10 15 天數(shù)FISH Counts468101214Plate Countscounts detected by FISH (Log CFU/g)counts detected by culture method (Log CFU/g) Bifidobacteria4681012140 4 7 10 15 天數(shù)FISH Counts468101214Plate Countscounts detected by FISH (Log CFU/g)counts detected by culture method (Log CFU/g) Enterococcus4681012140 4 7 10 15天數(shù)FISH Counts468101214Plate Countscounts detected by FISH (Log CFU/g)counts detected by culture method (Log CFU/g) Enterobacteriaceae4681012140 4 7 10 15 天數(shù)FISH Counts468101214Plate Countscounts detected by FISH (Log CFU/g)counts detected by culture method(Log CFU/g) 圖 36 FISH 技術(shù)與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的比較 Fecal microbiota counts (log CFU/g feces) of Lactobacillus, Bi?dobacteria, Enterococcus spp and Enterobacteriaceae before and after 4, 7,10, 15 days of assumption of CGMP detected by culture method and FISH techniques. 傳統(tǒng)培養(yǎng)法與 FISH技術(shù)得到的微生物菌落數(shù)變化趨勢是一致的，但是 FISH技術(shù)檢測得到的數(shù)據(jù)要明顯地高于傳統(tǒng)法。 ） %和（ 177。 （ log CFU/g 濕糞便 ） ，兩組小鼠腸 球 菌的數(shù)量較接近，沒有明顯的差異。對照組小鼠腸道內(nèi)腸桿菌 總菌的 比例在一定范圍內(nèi)波動，沒有明顯的規(guī)律，但 CGMP 組 小鼠腸道內(nèi)腸桿菌 總菌的 比例卻呈現(xiàn)出了逐漸下降的趨勢，在對小鼠 灌胃 CGMP 兩周后，小鼠腸道內(nèi)的腸桿菌降到了 （ 177。 從圖 34 可以看出，在對小鼠進行灌胃前 對照組中腸桿菌占腸道總菌的（ 177。 （ log CFU/g 濕糞便 ） ，兩組小鼠腸桿菌的數(shù)量較接近，沒有明顯的差異。 ） %， 比灌胃前的平均水平增長了 407%；雙歧桿菌所占比例 達到了（ 177。 ） %， 這 兩組 數(shù)據(jù) 充分說明在未對小鼠進行灌胃實驗材料之前，各組小鼠腸道內(nèi)乳酸桿菌 和雙歧桿菌 所占 總菌數(shù)的 比例基本 處于同一水平， 兩組小鼠 沒有 存在 明顯的 差異 。 從 圖 3 33 可以看出， 在實驗開始時對照組和 CGMP 組腸道內(nèi)乳酸桿菌占總菌數(shù)的百分比分別為 （ 177。（ log CFU/g 濕糞便 ） 相 比 ； 雙歧桿菌的數(shù)量 增加到了 177。 （ log CFU/g 濕糞便 ） ， 兩組 水平 基本一致，不存在明顯的差異。 Epi?uorescence images of bacterial cells from the mice fecal samples. (A): Total bacterial cells hybridized with EUB338 probe labeled by ROX at 5′ end. (B): Bacterial cells hybridized with Lactobacillus speci?c oligonucleotide probe (Lacb722FITC). (C): Bacterial cells hybridized with a Enterococcus oligonucleotide probe (ENC221FITC). (D): Bacterial cells hybridized with a Bi?dobacterium genusspeci?c oligonucleotide probe (Bif164FITC). (E): Bacterial cells hybridized with an Enterobacteriaceae oligonucleotide probe (Enter1432FITC). CGMP 對小鼠腸道乳酸桿菌 、雙歧桿菌 的影響 C D E 02468100 3 6 9 12 15試驗天數(shù)乳酸桿菌占總菌數(shù)的百分比對照組CGMP組 圖 32 CGMP 對小鼠腸道乳酸桿菌的影響 024680 3 6 9 12 15試驗天數(shù)雙歧桿菌占總菌的百分比對照組CGMP組 圖 33 CGMP 對小鼠腸道 雙歧桿菌 的影響 從表 35所示數(shù)據(jù)可以看出， 在實驗的第 0 天， 對照組和 CGMP 組 小鼠腸道內(nèi)乳酸桿菌的數(shù)量分別為： 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 上述四 種微生物 以及總菌落 熒光原位雜交圖片如圖 31所示， 所得四種腸道微生 物的菌落數(shù)如表 35 所示。因次兩次的試驗結(jié)果充分證明 A1B1C3 是最好的實驗條件。 7 3 1 3 177。 3 1 3 3 177。 因此 A2B3C1 是可能的最好條件，并且該實驗設(shè)計中有此條件組合，即6號試驗，并且 6號實驗結(jié)果也是 最好的，證明 A2B3C1 是最好的 雜交試驗 條件。 3因素 3 水平正交試驗直觀分析： (1)對溫度因素 A分別計算每種水平所對應(yīng)的總菌數(shù)平均值： 46℃ : K1A =++= 平均 值 ： 48℃ : K2A =++= 平均 值 ： 50℃ : K3A =++= 平均 值 ： (2)對探針濃度因素 B分別計算每種水平所對應(yīng)的總菌數(shù)平均值： 5ng/ul： K1B =++= 平均 值 ： 10ng/ul： K2B =++= 平均 值 ： 20ng/ul： K3B =++= 平均 值