【正文】 抗原為馬 1（ H7）亞型的）。 NI 測定已成為流感病毒鑒定不可缺少的手段之一。 D1． 3 223。 r2 r1=甲血清對乙抗原的血抑滴度 /甲血清對甲抗原的血抑滴度 r2=乙血清對甲抗原的血抑滴度 /乙血清對乙抗原的血抑滴度 R 為抗原比，當(dāng) R=1 時，表明兩株間抗原性相同； R 時，表明兩毒株間抗原性無明顯差異； R 為 1/— 1/2 時表明兩毒株的抗原性有小差異， R 值越大，差異越大。測定中所用的免疫血清包括既往流行過的代表株和用新分離病毒制備的免疫血清。以表 2 為例，加以說明。 C5． 1． 3． 5 于最后一孔加入 生理鹽水，其余各孔一律加入 四個凝集單位抗原，輕輕搖勻，置室溫 60 min。 C5． 1． 3 血抑測定 C5． 1． 3． 1 取一干凈的塑料板，標(biāo)明測定血清標(biāo)本，最后一孔為血清對照孔。配成后必須進行復(fù)核測定：取一塊干凈的大孔塑料板，在前三孔，也可任意連續(xù)的三孔，每孔加入 生理鹽水，用一根 1ml 的吸管， 取 四個血凝單位的抗原放入第一孔，倍比稀釋至第三孔， 吸出 棄之，然后每孔加入 ml 生理鹽水，再加入 1%紅細胞懸液，搖勻，置室溫 30— 60 min后，觀察結(jié)果。但有時經(jīng)處理的血清對測定的紅細胞有非特異性凝集。如 1， 1： 320 為 4 個加號， 1： 640 為陰性，應(yīng)為（ 320+640）/2=480。如表 1 中的 2， 1： 640 處僅一個加號，故血凝滴度一定小于 640，應(yīng)為 640640/8=560。表 1 中， 14， 6 和 7 不必進行整理，而 5 中，必須將 1： 640 處一個加號挪到 1： 320 處為 4 個加號，而 1： 160 處變成兩個加號，然后再進行計算。 C4． 3 紅細胞凝集滴度計算 結(jié)果以 ++為終點，亦即一個凝集單位。 紅細胞于孔底形成一個小團，邊緣光滑并有立體感，將板傾斜片刻，就可見紅細胞滑動象人的眼淚滴樣者為 — 。 一層紅細胞均勻地鋪于孔上者為 ++++。相混后置室溫或 4℃ 3060min，而后觀察結(jié)果。 C3． 4受體破壞酶（ RDE） C3． 5 免疫血清或測定血清 C4紅細胞凝集實驗 C4． 1 操作步驟 C4． 1． 1 取一干凈的大孔塑料板，標(biāo)記所要測定的標(biāo)本名稱 C4． 1． 2 于第一孔加入 （ 1： 2 開始稀釋）或 （ 1： 5 開始稀釋），從第二孔開始一律各加 %生理鹽水。 C2 實驗器材 C2． 1 大孔或小孔塑料板 C2． 2 10ml 或 1ml 或 1000ul 和 200ul 或多排吸管 C2． 3 200ul 和 1000ul 吸頭 C3 試劑 C3． 1 % 無菌生理鹽水 C3． 2 Alsever 氏液 葡萄糖 檸檬酸鈉 g 檸檬酸 g NaCl 0 .42g 加蒸餾水至 100ml 8 磅 20 分鐘高壓滅菌，置 4℃ 備用。這種毒株在雞胚尿囊腔適應(yīng)傳代后，獲得了在雞胚尿囊腔復(fù)制的能力，同時還獲得了對雞紅細胞凝集能力與人及豚鼠的一樣好，這種生物學(xué)特性發(fā)生改變的病毒為“ D”相毒株。 B4 結(jié)果判斷 凡恢復(fù)期血清抗體滴度比急性期增高≥ 4倍為陽性結(jié)果，其余的均為陰性結(jié)果。收集血清，棄血凝塊。急性期血樣應(yīng)盡早采集，一般不晚于發(fā)病后 7 天。 A6病毒鑒定 至今對流感病毒鑒定最常用的方法為紅細胞凝集抑制（ HI）測定，因該法簡便易行，結(jié)果可信（具體方法見附錄 C）。 A5． 2雞胚接種和收獲 取 911日胚齡雞胚，經(jīng)羊膜腔和尿囊腔接種標(biāo)本 ml， 每份標(biāo)本接種 34只胚， 置 3335℃培養(yǎng) 72h。 如 HA 陰性，應(yīng)在 MDCK 細胞上盲傳一代，如 HA 仍陰性，可認為是陰性標(biāo)本，棄之。由于 CPE不能證實就是流感病毒所造成。 A5 接種與 培養(yǎng) 最常用的為細胞接種和雞胚接種法，有條件的應(yīng)兩法并用。 A4 標(biāo)本處理 標(biāo)本至實驗室后，含棉拭子的標(biāo)本，先將棉拭子在管壁反復(fù)擠壓后取出。 注： 取漱口液時，需預(yù)先了解患者是否對抗菌素有過敏史，如有，含漱液中不應(yīng)含抗菌素。近來國內(nèi)有用小孩導(dǎo)尿管接在50 ml 注射器上來替代收集器。 注： 亦可將鼻、咽拭子收集于同一采樣管中，以便提高分離率，減少工作 量。以同一拭子拭兩側(cè)鼻孔。 標(biāo)本主要取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次為氣管和支氣管分泌物，有時也采用肺活檢材料等。 3． 4 病例分類 3． 4． 1 疑似病例（流感樣病例） 具備腋下體溫 ≥ 38℃，加上其他臨床癥狀兩項或以上，或加 1 及胃腸道癥狀兩項或以上。 3． 3 實驗室診斷 3． 3． 1 從病人鼻咽分泌物中可分離到流感病毒（見附錄 A）。 3 診斷標(biāo)準(zhǔn) 3． 1 流行病學(xué)資料 在流行季節(jié)一個單位或地區(qū)同時出現(xiàn)大量上呼吸道感染病人；或近期內(nèi)本地區(qū)或鄰近地區(qū)上呼吸道感染病人明顯增多；或醫(yī)院門診呼吸道感染病人明顯增多；或挨家挨戶上呼吸道感染患者明顯增多。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于各級醫(yī)療、衛(wèi)生、保健機構(gòu)和人員。 本標(biāo)準(zhǔn)的附錄 CF 是資料的附錄。因此，在附錄 E 中也加入后者的內(nèi)容。病毒分離中，因甲型流感病毒“ O”相特性的出現(xiàn)，故強調(diào)了細胞系統(tǒng)分離病毒的重要性；在 HA 測定中不應(yīng)用雞紅細胞，而應(yīng)用豚鼠或人的紅細胞。具體修改之處如 下： 1． 前言中強調(diào)了流感為一種人、禽、畜共患病，同時考慮到禽流感病毒在人群中可引起的流感，其傳播途徑不清楚，故把傳播途徑刪除。丙型流感病毒主要以散在形式出現(xiàn)，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流感流行，它也能感染豬。 中國最大的管理資源中心 7 附件 ICS GB 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) GB 流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則 Diagnostic criteria and principles of management of influenza (報 批 稿 ) 發(fā)布 實施 國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布 中國最大的管理資源中心 8 目 次 前言―――――――――――――――――――――――――――――――― 3 1 范圍――――――――――――――――――――――――――― ―――― 4 2 診斷原則――――――――――――――――――――――――――――― 4 3 診斷標(biāo)準(zhǔn)――――――――――――――――――――――――――――― 4 4 處理原則――――――――――――――――――――――――――――― 5 附錄 A （規(guī)范附錄） 病原學(xué)診斷方法――――――――――――――――― 5 附錄 B（規(guī)范附錄） 血清學(xué)診斷方法――――――――――――――――― 7 附錄 C（資料附錄） 紅細胞凝集抑制試驗――――――――――――――― 8 附錄 D（資料附錄）神經(jīng)氨酸酶活性抑制試驗―――――――――― ―――― 12 附錄 E（資料附錄） 對流免疫電泳及瓊脂凝膠沉淀試驗――――――――― 16 附錄 F（資料附錄） 流感快速診斷方法―――――――――――――――― 19 中國最大的管理資源中心 9 GB 前 言 流行性感冒 (簡稱流感 )為一種人、禽、畜共患的病毒性急性傳染病。 4．病人恢復(fù)期血清比急性期血清的 H5 抗體有 4 倍或以上增高。 六、 檢測結(jié)果的確認 以下情況的原始標(biāo)本及分離物送國家流感中心檢測、復(fù)核、確認。 試劑：雞胚接種采用 SPF 雞胚， MDCK 細胞等。 方法： RTPCR，用于禽 H5 亞型流感病毒的快速檢測、測序及排除工作 試劑： 特異性 H5 及甲型流感病毒的引物、 病毒 RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶、 Taq DNA 聚合酶等試劑 , 建議使用德國 QIAGEN 的 Rneasy Mini Kit (病毒核酸提取 ) 和 QIAquick Gel Extraction Kit（ PCR產(chǎn)物純化）產(chǎn)品。 （ 2）專人專車運送：主要用 于近距離樣品運送。同一患者 2 份以上的密封標(biāo)本，可以放在同一個塑料袋內(nèi)再次做密封。 4．標(biāo)本采集的方法： 詳見國標(biāo)《 流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》 四、送流感中心的標(biāo)本包裝、運送與接收 1．標(biāo)本的包裝 （ 1）標(biāo)本必須放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有橡膠圈的塑料管里 ，擰緊。 （ 2） 采集標(biāo)本時間： 1）咽、鼻拭子或含漱液在發(fā)病的頭 3 天采集； 2）急性期血清在發(fā)病后 7 天內(nèi)采集，恢復(fù)期血清在發(fā)病后 24周采集； 3）尸檢標(biāo)本尸檢時采集。 （ 3）特異性 H5 的 RTPCR 病毒核酸檢測陽性標(biāo)本的病毒分離必須在生物安全Ⅲ級（ BSL3 級）實驗室； （ 4）沒有生物安全Ⅲ級（ BSL3 級）實驗室的，將標(biāo)本送國家流感中心做病毒的分離工作。 （ 4）微量中和實驗、特異性 H5 的 RTPCR 病毒核酸檢測陽性的采樣標(biāo)本的病毒分離、尸檢標(biāo)本的檢測必須在安全Ⅲ級（ BSL3 級）實驗室里操作。 中國最大的管理資源中心 1 附 7 禽流感實驗室檢測技術(shù)方案 一、實驗室網(wǎng)絡(luò)設(shè)置 實驗室網(wǎng)絡(luò)由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所國家流感中心和省級流感實驗室兩級組成。 （ 3）特異性 H5 的 RTPCR 病毒核酸檢測在安全 Ⅱ 級 +（ BSL2級 +）實驗室的生物安全柜里提取病毒的核酸，進行病毒核酸檢測的實驗室要求請參照國家有關(guān)核酸檢測要求的規(guī)定。 3．省級流感實驗室 職責(zé) （ 1）禽流感采樣標(biāo)本的臨床標(biāo)本特異性 H5 的 RTPCR 病毒核酸檢測； （ 2）禽流感 H5 的血清學(xué)檢測工作 。 2．標(biāo)本采集種類和時限 （ 1）采集標(biāo)本的種類： 疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液、血清以及死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物。無－ 70 ℃條件的需在－20 ℃冰箱短時間暫存，并盡快聯(lián)系遞送標(biāo)本。 （ 4）將裝標(biāo)本的密封袋放入專用運輸箱內(nèi)（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔軟物質(zhì)填充，內(nèi)襯具吸水和緩沖能力的材料。 2．標(biāo) 本運送 （ 1）航空或鐵路運送。 中國最大的管理資源中心 5 五、標(biāo)本檢測方法 1．禽 H5 病毒核酸檢測： 材料： 疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物。 經(jīng)特異性 H5 RTPCR 病毒核酸檢測陽性的采樣標(biāo)本的病毒分離及鑒定工作必須在安全Ⅲ級（ BSL3 級）實驗室里操作。 4．微量中和試驗 材料：疑似病例的急性期和恢復(fù)期的雙份血清 試劑： H5 活病毒，必須在生物安全Ⅲ級 (BSL3 級 )實驗室里操作 。 3．標(biāo)本分離物血凝實驗（ HA） 陽性，同時 H5 的 RTPCR 檢測陽性。 當(dāng)實驗過程中出現(xiàn)不可預(yù)測情況或意外事件，影響了按時出具報告時，應(yīng)及時報告和說明。乙型流感病毒能引起流感局部暴發(fā)，不會造成世界性流感大流行，至今除在人以外還能在海豹中分離到它。 受衛(wèi)生部傳染病防治監(jiān)督管理辦公室委托，由郭元吉同志負責(zé)對流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則 GB159441995 進行修改，其目的：把過時的，不適用的刪除，加入適用新的內(nèi)容。 4． 附錄 A。 6． 刪除 B2 已 過時，操作復(fù)雜，易受實驗條件影響的“型特異性補體結(jié)合試驗，改為附錄 E“對流免疫電泳”，同時考慮到對禽血清抗體測定時，常用瓊脂凝膠沉淀試驗。 本標(biāo)準(zhǔn)的附錄 A 和 B 是規(guī)范的附錄。 中國最大的管理資源中心 10 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) 流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則 GB Diagnostic criteria and principles of management of influenza 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了流感的診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則。如確診則需要病毒分離陽性或病人雙份血清抗體測定，其恢復(fù)期抗體滴度較急性期增高 4 倍或以上，或 從患者采集的標(biāo)本中查到病毒粒特異的蛋白或特異核酸成分。 3． 2． 3 少數(shù)病例有食欲減退、伴有腹痛，腹脹、嘔吐和腹瀉等消化道癥狀。 3． 3． 4 采集標(biāo)本