【正文】 存在丙酮酸酶譜分析的 diVerent 干酪乳桿菌菌株的無細(xì)胞提取物上 SDSPAG 解決處理鈥淢動(dòng)脈插管和方法鈥箭頭參展的 NADH 氧化活性增加蛋白質(zhì)點(diǎn)中 LDH1 背景。類似結(jié)果也存在于含有或缺乏果糖 1,6二磷酸的過程中，這是 LDH1 激活（數(shù)據(jù)未顯示）。 BL252（ LDH1 LDH2） 。樂隊(duì)相應(yīng)的 HicD 酶被標(biāo)記面板 “基本法”第二十三條（野生型） 。單體 LDH2， LDH3 或 LDH4 突變株攜帶像野生型（數(shù)據(jù)未顯示）的表現(xiàn)。乳酸脫氫酶的酶譜檢測(cè)活動(dòng)的乳酸 LDH2， LDH3 和 LDH4 突變的低 eVect，合成促使我們尋找額外的存在 LDH 活性存在于干酪乳桿菌 BL23，我們?cè)噲D將粗提取物進(jìn)行酶譜分析檢測(cè)。有趣的是，增加的 D乳酸生產(chǎn) LDH1 應(yīng)變?cè)?LDH1 hicD雙突變中完全消失。表2 中可以看到， LDH1 突變對(duì)主要乳酸生產(chǎn)的影響，以減少乳酸總額的 37％的增幅，對(duì)D乳酸進(jìn)行了觀察。時(shí)相比，野生型，新的刪除突變（株 BL249）表現(xiàn)出類似的行為以前插入突變 BL176：培養(yǎng)上清總是達(dá)到了較高的 Wnal pH 值，它產(chǎn)生的 CO2 粗提取物中葡萄糖和 LLDH 活性降低 95％（數(shù)據(jù)未顯示）。（ 4）基因編碼的一種應(yīng)激反應(yīng)膜在 ATCC334（ LSEI_1313） GTP 酶是一個(gè) BL23 的假基因（圖 1）?？傊蚪M內(nèi)新的 LDH 基因沒有允許建立可能的假設(shè)細(xì)胞的作用。雖然 LDH2 似乎也是 monocistronic 的基因，但 LDH2 擁有在一些二元酸反應(yīng)步驟的脫氫作用證明它是合理的。 LDH4的酶是展示以 LDH1 的最低相似性和保持上述最差的序列。對(duì) LDHs 序列的推斷發(fā)現(xiàn)，類似于 LDH1， LDH2 和 LDH3 蛋白質(zhì)進(jìn)行守恒的 NADH 結(jié)合域中含有典型的GX G X X – G 紋路（ X 為任意氨基酸 圖 1 示意圖 4diVerent LDH 基因檢測(cè)干酪乳桿菌基本法第二十三條連同他們的基因組范圍內(nèi)。 結(jié)論 LDH 的同源基因存在于干酪乳桿菌 BL23 的基因組干酪乳桿菌，除了先前描述的乳酸脫氫酶 BL23 [8， 19]，在研究 LDH 同源性 BLAST 搜索干酪 BL23 基因組草圖（ 96％的序列覆蓋率）呈現(xiàn)三個(gè)額外的推測(cè) LDHs 的基因編碼。在第二個(gè)用含有 10％的 PAG 電泳進(jìn)行檢測(cè) ％ SDS。 表 1菌株和質(zhì)粒 乳酸脫氫酶酶譜分析 細(xì)胞成倍生長在 10 毫升的 MRS 培養(yǎng)基中的干酪乳桿菌野生型和突變株通過離心回收，用 100 毫摩爾的 TrisHCl 在 pH 值 條件 下在同一 buVer 中加入 1 毫摩爾 硫代1 ,4threitol 毫摩爾 phenylmethylsulphonyl 的 xuoride 洗滌。色譜法在 50176。一些克隆體在含有紅霉素的 MRS 培養(yǎng)基上生長約 200 代沒有產(chǎn)生抗生素，稀釋過后培養(yǎng)的菌種亦是如此。限制性內(nèi)切酶， DNA 的 modiWcation 酶和 T4 連接酶為 New England Biolabs公司和 Roche 公司生產(chǎn)。另外有 500 bp 的 5ˊ LDH1 在上游區(qū)域與寡核苷酸 ampliWed 5ˊCGGGGTACCGTCGTTTGGCCAAGCCATC 和 5ˊ TTCAAGCAAGCTTCCAATAAC 并 克隆到上述質(zhì)粒 PSTI（消化鈍與 Klenow 酶）。一個(gè)519 bp 的片段從 LDH2 ampliWed PCR 結(jié)合寡核苷酸 5ˊ GATTCCCTACCTTACACG 和 5ˊTCTCAATGATGCCATAAGC 與 EcoRV 分為 pRV300 消化的克隆，給予 pRVldh2。 克，并輔以 ％（ W / V）葡萄糖，在 37℃下靜置。 材料和方法： 菌株和生長條件： 在這項(xiàng)研究中干酪乳桿菌菌株的使用在表 1 中列出。此外，代謝工程戰(zhàn)略應(yīng)用于 NADH 氧化再加上一個(gè)替代的丙酮酸的代謝，導(dǎo)致附加代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生 [4， 6， 13， 17]。在這個(gè)意義上說，基因突變從植物乳桿菌的 L 型和 D 型上開始編碼，使該生物體產(chǎn)生 50％的 D 型跟 50％ L 型的混合物，從來沒有導(dǎo)致乳酸生產(chǎn) [3]的完全缺失。 LDH1 基因編碼合成的 LLDH，而 hicD 編碼一個(gè)Dhydroxyisocaproate 提供了 D乳酸脫氫酶。這些結(jié)果表明， LBL23 具有一個(gè)復(fù)雜的酶系統(tǒng)，能夠減少乳酸丙酮酸。 LDH2， LDH3 和 LDH4 基因乳酸生產(chǎn)中發(fā)揮的作用不大，因?yàn)樗麄兊?單一突變或在組合與 LDH1 缺失突變對(duì) L乳酸合成的影響很小。此外， D乳 酸的異構(gòu)體的少量產(chǎn)生一個(gè) Dhydroxycaproate 脫氫酶（ HicD）的活動(dòng)。nez a Jes Mar237。rezMart237。學(xué)會(huì)工業(yè)微生物 2021 摘要： 干酪乳桿菌是一種通過通過 L乳酸脫氫酶（ LDH1）的作用促使糖發(fā)酵主要生產(chǎn)L乳酸的乳酸菌。為了研究這些基因?qū)θ虻倪@種微生物的貢獻(xiàn)，個(gè)體乳酸以及雙突變體（ LDH1 LDH2， LDH1 LDH3， LDH1， LDH4 和 LDH1hicD）的生產(chǎn)，構(gòu)建了乳酸生產(chǎn)的上清培養(yǎng)評(píng)估。此外，這些檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在額外的頻段表現(xiàn)出 D/Llactate 脫氫酶活性，這不能歸咎于任何所描述的基因。在乳酸菌干酪 BL23，一些菌株已被廣泛用于遺傳，生理和生化研究，這兩個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)乳酸脫氫酶活性已被描述 [8， 12， 19]。一個(gè)與其他實(shí)驗(yàn)室刪除 LDH 基因相似的行為也有報(bào)道。 EVorts 已作出建設(shè)在一個(gè) aVected 或乳酸菌菌株上的幾個(gè)的identiWed LDH 基因，因?yàn)樗鼈兛梢杂迷谕ㄟ^非消旋，光發(fā)酵等途徑生產(chǎn)活性乳酸 [1]。在嘗試探索的基因負(fù)責(zé)殘留在干酪乳桿菌乳酸生產(chǎn) BL23 的 LDH1 突變體，我們探索其是否存在額外的LDH 基因突變以及在 eVects 乳酸生產(chǎn)上新發(fā)現(xiàn)的 LDHs 的基因組。 ， 克 。 質(zhì)粒和突變株的構(gòu)建： pRV300 質(zhì)粒 [11]用于興建綜合載體內(nèi)部碎片的 ， LDH2， LDH3， LDH4。要構(gòu)建的 PRV Δ LDH1 質(zhì)粒攜帶融合 5ˊ和 3ˊ的 LDH1 區(qū)域， 500 bp 的片段相應(yīng) LDH13ˊ下游地區(qū)與寡核苷酸 5ˊ CGACACCGAGA ampliWed ATTTCTGTG 和 5ˊACATGGATGGTCAATATGGC 并克隆到 pRV300 用 EcoRI 消化（作出鈍的 Klenow DNApolI 的片段）。 PCR 產(chǎn)物凝膠 puriWed 的 gfxPCR puriWcation 試劑盒（ GE醫(yī)療機(jī)構(gòu)）。構(gòu)建 LDH1 缺陷菌株，干酪乳桿菌 BL23 通過克隆選擇轉(zhuǎn)化為 PRVΔ LDH1 和耐紅霉素。有機(jī)酸上清液用 JASCO PU2080Plus HPLC系統(tǒng)，耦合紫外檢測(cè)器（ 210 nm），以及使用 Rezex ROAOrganic色譜柱進(jìn)行測(cè)定。目前在生長培養(yǎng)基中的糖的測(cè)定方法來自 RBiopharm 公司的 D葡萄糖試劑盒。細(xì)胞的提取物被加到了 6％的非變性 PAG 和稀釋的 90V中，在加入 100mM pH 值 的三乙醇胺 buVer， mM 的 NAD+， 毫克 /毫升硝基四氮唑， 毫克 /毫升的 phenazyne methosulfate，或者 200mM 的 L乳酸或 200mM的有 50％的 D乳酸 50％的 L乳酸的混合物的凝膠電泳培養(yǎng)后檢測(cè)乳酸脫氫酶活性。 核苷酸加入編號(hào) 本文報(bào)道的核苷酸序列已在 EMBL 數(shù)據(jù)庫存依次加入數(shù)字序號(hào) AM886174， AM886175，AM886176 和 AM886177。在 LDH4 中，序列在 80 左右開始的氨基酸的同源性為 L 型 LDHs，而 WRST N末端氨基酸只共享 1 signiWcant， N末端的二級(jí)乳酸脫氫酶的同源性從乳酸乳球菌（ LDH2）。此外，催化的 MGEH 型的 G [D/E] [S/T]位點(diǎn)的研究，其中 H 是催化組氨酸，同時(shí)也表現(xiàn)在 LDH2 和 LDH3 中，從而支持了潛在的乳酸脫氫酶的假設(shè)編碼。 LDH2 是通過 divergently 轉(zhuǎn)錄 GDH基因編碼在 Xanked五肽尾的 NADP依賴谷氨酸脫氫酶在 三肽尾由基因編碼假定的氨基酸酸和羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)。雖然丙酮酸脫氫酶是復(fù)雜的，因?yàn)樗婕霸诤醚鯒l件下將丙酮酸的代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn) 換成乙酰輔酶 A 的化合物，果糖 1,6二磷酸酶在糖質(zhì)新生途徑，因此沒有與 LDH 有明確的聯(lián)系。（ 3）基因編碼推測(cè) PADR在 BL23 的缺失似乎是從 ATCC 334 開始 。后 WRST 單 交叉融合，是一個(gè)穩(wěn)定的突變選擇進(jìn)行了第二次重組事件，從而導(dǎo)致了 LDH1 完整的染色體缺失。為了研究上 eVect 的 diVerent 突變?nèi)樗嵘a(chǎn)，所有菌株生長在含 ％葡萄糖和乳酸的 MRS 培養(yǎng)基上測(cè)得完成后對(duì)葡萄糖的利用。這些結(jié)果表明，在沒有 LDH1 的條件下，要么 LDH2 或 LDH4， HicD 或其它的 D乳酸產(chǎn)酶可能減少丙酮酸率較高（見表 2）。然而，在 hicD 突變過程中，小野生型的 D乳酸的生產(chǎn)仍在觀察。相反，其余的突變并沒有產(chǎn)生 1 diVerent 的則帶 proWle，因此，沒有蛋白帶可以分配到產(chǎn)物或 LDH1， LDH2， LDH3或 LDH4。箭頭指向參展乳酸脫氫酶的蛋白條帶活動(dòng)。 BL189（ hicD） 。這個(gè)在任何的 LDH 突變過程中沒有消失的頻段是增加攜帶 LDH1 缺失株的信號(hào)，提示它對(duì)應(yīng)酶的活性，這是誘導(dǎo)后 LDH1 突變（箭頭 2 圖 2a， b）的。一個(gè)沒有丙酮酸控制凝膠除外， HicD 帶了相同的結(jié)果缺失（數(shù)據(jù)未顯示）。 BL249（ LDH1） 。BL271（ LDH1 LDH3）和 BL273（ LDH1 LDH4） 檢測(cè)和強(qiáng)度增加了 LDH1 背景（圖 3）。在其他因素方面，這可能會(huì)產(chǎn)生氧化增加 NADH 的其他途徑（即乙醇生產(chǎn)）和替代 LDH 基因 [13]的表達(dá)。兩種可能性可以解釋：（ 1）檢測(cè)乳酸最佳實(shí)驗(yàn)條件額外 的 LDH 酶（ S）或脫氫酶的活性在起作用（ 2）一個(gè)非常低的 LDH 活性，就足以讓乳酸在低濃度下大幅度堆積增長。存在這樣的可能性，它們?cè)谝粋€(gè)基因 deWciency 上的編碼可以彌補(bǔ)另外兩個(gè)基因多余的LDH。這種 eVect 菌在 LDH1 hicD 雙突變的情況下完全恢復(fù)。一個(gè)附加的 HicD 探索在BL23基因編碼的酶的基因編碼為 33％ HicD的蛋白，這是 100％的同源性到 LSEI_2156，存在的 ATCC334 基因組 [14]。然而，目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，少量生產(chǎn)的Dlactate 在 hicD 株野生型中更加持久。因此，這種酶不遷移，在非變性凝膠是不可逆轉(zhuǎn)的，經(jīng) SDS 或滅活其活性丟失后凝膠電泳是可能的。存在一個(gè)額外的頻段表現(xiàn)出 L 型 LDH 在酶譜的活動(dòng)表明，酶法機(jī)械干酪乳桿菌 BL23 的丙酮酸減少是比預(yù)期更復(fù)雜的。這強(qiáng)調(diào)需要一個(gè)更深層次干酪乳桿菌代謝的知識(shí)為基礎(chǔ)，這些化合物進(jìn)一步的代謝工程的方法。n233。 參考文獻(xiàn)： J, von Weymarn N, Ronnholm K, Leisola M, Palva A 乳酸菌發(fā)酵的代謝工程（ 2021）甘露醇和純 L乳酸或丙酮酸生產(chǎn) .生物工程 Bioeng82:653663 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