【正文】 英語(yǔ)外文翻譯作業(yè) 外文資料翻譯譯文 ： 在酪干乳桿菌 BL23 的 LDH 基因分析：乳酸生產(chǎn)上的作用 Juan Rico Mar237。a Jess Yebra Gaspar P233。rezMart237。nez Josef Deutscher Vicente Monedero 收稿日期： 2021 年 12 月 21 日 /接受日期： 2021 年 1 月 13 日 /發(fā)表時(shí)間： 2021 年1 月 30 日 169。學(xué)會(huì)工業(yè)微生物 2021 摘要： 干酪乳桿菌是一種通過(guò)通過(guò) L乳酸脫氫酶（ LDH1）的作用促使糖發(fā)酵主要生產(chǎn)L乳酸的乳酸菌。此外， D乳 酸的異構(gòu)體的少量產(chǎn)生一個(gè) Dhydroxycaproate 脫氫酶（ HicD）的活動(dòng)。 LDH1 是主要的 L乳酸生產(chǎn)酶，但突變它的基因并沒(méi)有消除 L乳酸的合成。一項(xiàng)稱作 “干酪乳桿菌基本法第二十三條草案的基因組序列”的調(diào)查揭示了相關(guān)的另外三個(gè)基因編碼乳酸脫氫酶旁系。為了研究這些基因?qū)θ虻倪@種微生物的貢獻(xiàn)，個(gè)體乳酸以及雙突變體（ LDH1 LDH2， LDH1 LDH3， LDH1， LDH4 和 LDH1hicD）的生產(chǎn)，構(gòu)建了乳酸生產(chǎn)的上清培養(yǎng)評(píng)估。 LDH2， LDH3 和 LDH4 基因乳酸生產(chǎn)中發(fā)揮的作用不大，因?yàn)樗麄兊?單一突變或在組合與 LDH1 缺失突變對(duì) L乳酸合成的影響很小。 ΔLDH1突變體顯示 D乳酸產(chǎn)量增加，這是可能通過(guò)活動(dòng) HicD合成，因?yàn)樗窃谌∠?Δ LDH1 hicD 的雙突變。相反，可能是 HicD，在沒(méi)有 LDH1， LDH2， LDH3 或 LDH4 活動(dòng)的情況下通過(guò)酶譜分析檢測(cè)。此外，這些檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在額外的頻段表現(xiàn)出 D/Llactate 脫氫酶活性，這不能歸咎于任何所描述的基因。這些結(jié)果表明， LBL23 具有一個(gè)復(fù)雜的酶系統(tǒng)，能夠減少乳酸丙酮酸。 關(guān)鍵詞： 干酪乳桿菌、乳酸菌、 Hydroxycaproate 脫氫酶、乳酸 脫氫酶、代謝工程 簡(jiǎn)介： 糖代謝乳酸菌（ LAB）的特點(diǎn)是通過(guò)乳酸脫氫酶的作用主要發(fā)酵生產(chǎn)乳酸產(chǎn)品，從而降低丙酮酸，乳酸。從生物技術(shù)的觀點(diǎn)來(lái)看乳酸的生產(chǎn)是非常重要的，因?yàn)樗梢援a(chǎn)生許多自然發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)室資源，它可以用在食品，制藥和生物聚合物產(chǎn)業(yè) [7]。在乳酸菌干酪 BL23，一些菌株已被廣泛用于遺傳，生理和生化研究，這兩個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)乳酸脫氫酶活性已被描述 [8， 12， 19]。 LDH1 基因編碼合成的 LLDH，而 hicD 編碼一個(gè)Dhydroxyisocaproate 提供了 D乳酸脫氫酶。在這種細(xì)菌 [19]上與 突變株相關(guān)的 L乳酸 和 D乳酸的形成表明突變株已在這兩個(gè)基因上建成。然而，干酪乳桿菌 BL23 顯示 LDH1突變體仍然產(chǎn)生大量的 L乳酸 D乳酸。一個(gè)與其他實(shí)驗(yàn)室刪除 LDH 基因相似的行為也有報(bào)道。在這個(gè)意義上說(shuō)，基因突變從植物乳桿菌的 L 型和 D 型上開(kāi)始編碼，使該生物體產(chǎn)生 50％的 D 型跟 50％ L 型的混合物，從來(lái)沒(méi)有導(dǎo)致乳酸生產(chǎn) [3]的完全缺失。 1 乳酸乳桿菌 sakei 的突變，在缺乏 D乳酸脫氫酶活性酸菌的條件下，將導(dǎo)致具有強(qiáng)烈降低 L型和 D型的乳酸的菌株生產(chǎn)（ D異構(gòu)體在消旋活動(dòng)的作用下能夠轉(zhuǎn)換成 L Dlactate）但仍然產(chǎn)生少量的乳酸 [15]。最后乳酸菌的發(fā)酵在 ldhL 、 ldhD 雙基因剔除的情況下仍然能夠合成乳酸 [1]。 EVorts 已作出建設(shè)在一個(gè) aVected 或乳酸菌菌株上的幾個(gè)的identiWed LDH 基因，因?yàn)樗鼈兛梢杂迷谕ㄟ^(guò)非消旋，光發(fā)酵等途徑生產(chǎn)活性乳酸 [1]。此外，代謝工程戰(zhàn)略應(yīng)用于 NADH 氧化再加上一個(gè)替代的丙酮酸的代謝，導(dǎo)致附加代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生 [4， 6， 13， 17]。然而，已知的缺失乳酸脫氫酶基因的結(jié)合酶活性的表達(dá)并不總是能夠降低丙酮酸 suYcient 改道對(duì)其他分子比如 signiWcant 丙酮酸 XOW 乳酸 diVerent的影響。由于這些原因，一個(gè)更好的涉及乳酸合成酶的研究將成為必要。在嘗試探索的基因負(fù)責(zé)殘留在干酪乳桿菌乳酸生產(chǎn) BL23 的 LDH1 突變體，我們探索其是否存在額外的LDH 基因突變以及在 eVects 乳酸生產(chǎn)上新發(fā)現(xiàn)的 LDHs 的基因組。 材料和方法： 菌株和生長(zhǎng)條件： 在這項(xiàng)研究中干酪乳桿菌菌株的使用在表 1 中列出。他們生長(zhǎng)在 MRS 培養(yǎng)基（ Oxoid公司）或 MRS 基本培養(yǎng)基中，每公升含：蛋白胨 10 克，肉類(lèi)提取物 8 克，酵母提取物4 克，吐溫 80， 1 毫升， K2HPO42 克 。檸檬酸銨 2 克 。 ， 克 。， 克，并輔以 ％（ W / V）葡萄糖，在 37℃下靜置。大腸桿菌 DH5α是作為一個(gè)克隆宿主，在 LB 培養(yǎng)基中 37℃條件下攪拌生長(zhǎng)，對(duì)于選擇干酪乳桿菌的轉(zhuǎn)化體，將 5 克 /毫升的紅霉素加入培養(yǎng)基中。氨芐青霉素則用在 100 克 /毫升大腸桿菌中。 質(zhì)粒和突變株的構(gòu)建： pRV300 質(zhì)粒 [11]用于興建綜合載體內(nèi)部碎片的 ， LDH2， LDH3， LDH4。一個(gè)519 bp 的片段從 LDH2 ampliWed PCR 結(jié)合寡核苷酸 5ˊ GATTCCCTACCTTACACG 和 5ˊTCTCAATGATGCCATAAGC 與 EcoRV 分為 pRV300 消化的克隆，給予 pRVldh2。一 505 bp的 LDH3 內(nèi)部片段是與 5ˊ GTG ampliWed TTATTTCCGCGGTC 和 5ˊ GCTTAGCCTGATAAA 與SMAI 消化 TCTTC 和克隆到 pRV300 給 pRVldh3。 LDH4 的 437 bp 的片段， ampliWed 5ˊ TCTCAATTCAGCGATGGC 和 5ˊ CTACATCATCAGATGCG 和克隆到 EcoRV 消化 pRV300 來(lái)給pRVldh4。要構(gòu)建的 PRV Δ LDH1 質(zhì)粒攜帶融合 5ˊ和 3ˊ的 LDH1 區(qū)域， 500 bp 的片段相應(yīng) LDH13ˊ下游地區(qū)與寡核苷酸 5ˊ CGACACCGAGA ampliWed ATTTCTGTG 和 5ˊACATGGATGGTCAATATGGC 并克隆到 pRV300 用 EcoRI 消化（作出鈍的 Klenow DNApolI 的片段）。另外有 500 bp 的 5ˊ LDH1 在上游區(qū)域與寡核苷酸 ampliWed 5ˊCGGGGTACCGTCGTTTGGCCAAGCCATC 和 5ˊ TTCAAGCAAGCTTCCAATAAC 并 克隆到上述質(zhì)粒 PSTI（消化鈍與 Klenow 酶）。克隆含有質(zhì)粒與導(dǎo)致在正確的方向碎片被identiWed 限制分析，并命名為 PRVΔ LDH1。 PCR 的進(jìn)行與展開(kāi)高精度聚合酶（ Roche）從桿菌屬 BL23 染色體 DNA。 PCR 產(chǎn)物凝膠 puriWed 的 gfxPCR puriWcation 試劑盒（ GE醫(yī)療機(jī)構(gòu)）。限制性內(nèi)切酶， DNA 的 modiWcation 酶和 T4 連接酶為 New England Biolabs公司和 Roche 公司生產(chǎn)。 干酪乳桿菌菌株的轉(zhuǎn)化 pRVldh2， pRVldh3， pRVldh4 和 pVBhic[19]通過(guò) GenePulser 儀（ BioRad 公司）和MRS 平板轉(zhuǎn)化紅霉素。通過(guò)與相應(yīng)的寡核苷酸和 DNA 聚合酶鏈反應(yīng)轉(zhuǎn)化在正確的位點(diǎn)整合測(cè)試。構(gòu)建 LDH1 缺陷菌株，干酪乳桿菌 BL23 通過(guò)克隆選擇轉(zhuǎn)化為 PRVΔ LDH1 和耐紅霉素。一些克隆體在含有紅霉素的 MRS 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)約 200 代沒(méi)有產(chǎn)生抗生素，稀釋過(guò)后培養(yǎng)的菌種亦是如此。 BL249（ Δ LDH1）被選定為第二應(yīng)變基因重組導(dǎo)致質(zhì)粒切除留下缺失性的 LDH1，經(jīng) PCR conWrmed 執(zhí)行從敏感紅霉素克隆的 DNA 的分離。 有機(jī)酸和葡萄糖的測(cè)定 干酪乳桿菌 細(xì)胞培養(yǎng)初期在輔以 ％葡萄糖的 MRS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)。有機(jī)酸上清液用 JASCO PU2080Plus HPLC系統(tǒng)，耦合紫外檢測(cè)器（ 210 nm），以及使用 Rezex ROAOrganic色譜柱進(jìn)行測(cè)定。色譜法在 50176。 C 與 5 mM 的硫酸作為溶劑， XOW 速率 毫升 /分鐘的條件下進(jìn)行。 D乳酸和 L乳酸的同分異構(gòu)體的比例來(lái)自 RBiopharm 公司的D/Llactic 酸性試劑盒上（德國(guó)達(dá)姆施塔特公司）。目前在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的糖的測(cè)定方法來(lái)自 RBiopharm 公司的 D葡萄糖試劑盒。 表 1菌株和質(zhì)粒 乳酸脫氫酶酶譜分析 細(xì)胞成倍生長(zhǎng)在 10 毫升的 MRS 培養(yǎng)基中的干酪乳桿菌野生型和突變株通過(guò)離心回收，用 100 毫摩爾的 TrisHCl 在 pH 值 條件 下在同一 buVer 中加入 1 毫摩爾 硫代1 ,4threitol 毫摩爾 phenylmethylsulphonyl 的 xuoride 洗滌?；蝿?dòng)玻璃珠使細(xì)胞被打破：用迷你 Beadbeater（直徑 毫米）（ Biospec）在 12021 轉(zhuǎn) 4176。C 條件下離心 10 分鐘去除細(xì)胞碎片。細(xì)胞的提取物被加到了 6％的非變性 PAG 和稀釋的 90V中，在加入 100mM pH 值 的三乙醇胺 buVer， mM 的 NAD+， 毫克 /毫升硝基四氮唑， 毫克 /毫升的 phenazyne methosulfate，或者 200mM 的 L乳酸或 200mM的有 50％的 D乳酸 50％的 L乳酸的混合物的凝膠電泳培養(yǎng)后檢測(cè)乳酸脫氫酶活性。在第二個(gè)用含有 10％的 PAG 電泳進(jìn)行檢測(cè) ％ SDS。凝膠浸泡 60 分鐘，在 2％的 Triton X100 中消除 SDS 并轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有 100mM 三乙醇胺 buVer pH 值 ， 10mM 果糖 4,6 二磷酸， 1mMNADH 和 25mM 丙酮酸鈉的途徑，培養(yǎng) 60 分鐘后，凝膠用清水沖洗 30 分鐘置于含有 /毫升硝基四唑和 /毫升 phenazyne methosulfate中培 養(yǎng)。蛋白質(zhì)的頻段為在一個(gè)黑暗背景下的清晰條帶證明了 NADH 的氧化酶活性。 核苷酸加入編號(hào) 本文報(bào)道的核苷酸序列已在 EMBL 數(shù)據(jù)庫(kù)存依次加入數(shù)字序號(hào) AM886174， AM886175，AM886176 和 AM886177。 結(jié)論 LDH 的同源基因存在于干酪乳桿菌 BL23 的基因組干酪乳桿菌，除了先前描述的乳酸脫氫酶 BL23 [8， 19]，在研究 LDH 同源性 BLAST 搜索干酪 BL23 基因組草圖（ 96％的序列覆蓋率）呈現(xiàn)三個(gè)額外的推測(cè) LDHs 的基因編碼。 “三個(gè)額外的 LDHs（ LDH2， LDH3 和 LDH4）百分比 49%， 31%和 24％，當(dāng)與干酪乳桿菌 BL23LDH1 酶相比。 LDH2 具有乳酸 /蘋(píng)果酸脫氫酶的同源性，而 LDH3 是相似的 Lhydroxyisocaproate 細(xì)菌脫氫酶。在 LDH4 中，序列在 80 左右開(kāi)始的氨基酸的同源性為 L 型 LDHs，而 WRST N末端氨基酸只共享 1 signiWcant， N末端的二級(jí)乳酸脫氫酶的同源性從乳酸乳球菌（ LDH2）。對(duì) LDHs 序列的推斷發(fā)現(xiàn)，類(lèi)似于 LDH1， LDH2 和 LDH3 蛋白質(zhì)進(jìn)行守恒的 NADH 結(jié)合域中含有典型的GX G X X – G 紋路（ X 為任意氨基酸 圖 1 示意圖 4diVerent LDH 基因檢測(cè)干酪乳桿菌基本法第二十三條連同他們的基因組范圍內(nèi)?；液袑?duì)應(yīng)序列潛水員從 L干酪 ATCC334。莖環(huán)代表假 定的轉(zhuǎn)錄終結(jié) 酸）。此外，催化的 MGEH 型的 G [D/E] [S/T]位點(diǎn)的研究，其中 H 是催化組氨酸，同時(shí)也表現(xiàn)在 LDH2 和 LDH3 中，從而支持了潛在的乳酸脫氫酶的假設(shè)編碼。 LDH4的酶是展示以 LDH1 的最低相似性和保持上述最差的序列。為了分配假定的設(shè)想，對(duì)新的蛋白質(zhì)的遺傳背景其相應(yīng)的基因進(jìn)行了研究（圖 1）。正如前面描述， LDH1 是monocistronic 基因并沒(méi)有位于它旁邊的基因碳代謝。 LDH2 是通過(guò) divergently 轉(zhuǎn)錄 GDH基因編碼在 Xanked五肽尾的 NADP依賴谷氨酸脫氫酶在 三肽尾由基因編碼假定的氨基酸酸和羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)。雖然 LDH2 似乎也是 monocistronic 的基因，但 LDH2 擁有在一些二元酸反應(yīng)步驟的脫氫作用證明它是合理的。 LDH3 是 Xanked 編碼基因假定的脫乙?；?，膜蛋白和 ADPribose 焦。 LDH4 是位于在 3ˊ肽尾一個(gè)丙酮酸 diVerent 亞基編碼基因簇脫氫酶復(fù)合體，似乎形成一個(gè)操縱子一個(gè)保護(hù)假設(shè)蛋白和編碼假定基因古型果糖1， 6二磷酸酶的 inositolmonophosphatase 種群。雖然丙酮酸脫氫酶是復(fù)雜的，因?yàn)樗婕霸诤醚鯒l件下將丙酮酸的代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn) 換成乙酰輔酶 A 的化合物，果糖 1,6二磷酸酶在糖質(zhì)新生途徑，因此沒(méi)有與 LDH 有明確的聯(lián)系?？傊蚪M內(nèi)新的 LDH 基因沒(méi)有允許建立可能的假設(shè)細(xì)胞的作用。進(jìn)行了類(lèi)似的搜索使用研究干酪 ATCC334 的完整的基因組序列 [14]，新提出的干酪乳桿菌型應(yīng)變，揭示了相同的額外 LDH 基因的發(fā)生。遺傳結(jié)構(gòu)是相同的 DNA 攜帶的 LDHs 菌株除外：（ 1）在 ATCC33