【正文】 were cultured to early stationary phase in MRS basal medium supplemented with % glucose. The anic acids were measured in the supernatants with a Jasco PU2080Plus HPLC system coupled to an UV detector (210 nm) and using a Rezex ROAOrganic Acid column. Chromatography was carried out at 50 176。 meat extract,8 g。rezMart237。nez G, Yebra MJ（ 2021）山梨醇合成一個精心設(shè)計的干酪乳桿菌菌株，表達山梨醇 6 磷酸脫氫酶基因的乳糖操縱子內(nèi) .前沿微生物 LETT 249:177183 18. Platteeuw C, Hugenholtz J, Starrenburg M, Vanalenboerrigter I,de Vos WM（ 1995）乳酸鏈球菌的代謝工程 ： inXuence 的α 乙酰乳酸合成酶的生產(chǎn)過剩作為一種文化的功能，乳酸脫氫酶 deWcient 的株條件 .應(yīng)用與環(huán)境微生物 61:39673971 19. Viana R, Yebra MJ, Gal225。asanta 部分資金中船重 工研究生獎學金獲得者，在大學的 L. casei BL23 的基因組進行測序，卡昂， Laboratoire 德Microbiologie DE L39。 NADH / NAD LDH1缺失造成的不平衡可部分彌補 NADH 的表達，這可能是對 O2的依賴，并在一些實驗室的氧化酶占相當比例的 NADH 的循環(huán)利用 [5]。盡管這種推測 HicD 酶發(fā)揮了 D乳酸合成的作用仍有待證明。此外，存在表現(xiàn)出 LDH 活性酶譜分析的額外波段指向存在其他 unidentiWed 酶能降低丙酮酸，乳酸。在這工作中，我們試圖確定是否四個基因的研究 BL23 基因組假設(shè)干酪乳酸脫氫酶編碼將有助于乳酸合成。 BL189（ hicD） 。在第二組實驗中，細胞提取物在 SDSPAGE和 SDS 被去除之后被解析出來，由于 NADH 的氧化能力蛋白質(zhì)在凝膠中是可見的。 BL249（ LDH1） 。在 1 WRST 一系列的實驗，細胞提取物的幾株被裝上非變性凝膠和氧化的能力乳酸，加上減少的色基板四氮唑藍（圖 2）。 LDH2， LDH3 和 LDH4 單突變體的表現(xiàn)像野生型（數(shù)據(jù)未顯示）。 構(gòu)建不同 LDH 突變及其乳酸生產(chǎn)效果 在以前的工作， LDH1 構(gòu)建插入突變一個非復制的質(zhì)粒攜帶一個內(nèi)部片段基因 [19]。 LDH3 是 Xanked 編碼基因假定的脫乙?；福さ鞍缀?ADPribose 焦?；液袑?yīng)序列潛水員從 L干酪 ATCC334。凝膠浸泡 60 分鐘，在 2％的 Triton X100 中消除 SDS 并轉(zhuǎn)移到一個含有 100mM 三乙醇胺 buVer pH 值 ， 10mM 果糖 4,6 二磷酸， 1mMNADH 和 25mM 丙酮酸鈉的途徑，培養(yǎng) 60 分鐘后，凝膠用清水沖洗 30 分鐘置于含有 /毫升硝基四唑和 /毫升 phenazyne methosulfate中培 養(yǎng)。 C 與 5 mM 的硫酸作為溶劑， XOW 速率 毫升 /分鐘的條件下進行。 干酪乳桿菌菌株的轉(zhuǎn)化 pRVldh2， pRVldh3， pRVldh4 和 pVBhic[19]通過 GenePulser 儀（ BioRad 公司）和MRS 平板轉(zhuǎn)化紅霉素。一 505 bp的 LDH3 內(nèi)部片段是與 5ˊ GTG ampliWed TTATTTCCGCGGTC 和 5ˊ GCTTAGCCTGATAAA 與SMAI 消化 TCTTC 和克隆到 pRV300 給 pRVldh3。他們生長在 MRS 培養(yǎng)基（ Oxoid公司）或 MRS 基本培養(yǎng)基中，每公升含：蛋白胨 10 克，肉類提取物 8 克，酵母提取物4 克，吐溫 80， 1 毫升， K2HPO42 克 。 1 乳酸乳桿菌 sakei 的突變，在缺乏 D乳酸脫氫酶活性酸菌的條件下，將導致具有強烈降低 L型和 D型的乳酸的菌株生產(chǎn)（ D異構(gòu)體在消旋活動的作用下能夠轉(zhuǎn)換成 L Dlactate）但仍然產(chǎn)生少量的乳酸 [15]。 關(guān)鍵詞： 干酪乳桿菌、乳酸菌、 Hydroxycaproate 脫氫酶、乳酸 脫氫酶、代謝工程 簡介： 糖代謝乳酸菌（ LAB）的特點是通過乳酸脫氫酶的作用主要發(fā)酵生產(chǎn)乳酸產(chǎn)品，從而降低丙酮酸，乳酸。 LDH1 是主要的 L乳酸生產(chǎn)酶，但突變它的基因并沒有消除 L乳酸的合成。s Yebra Gaspar P233。一項稱作 “干酪乳桿菌基本法第二十三條草案的基因組序列”的調(diào)查揭示了相關(guān)的另外三個基因編碼乳酸脫氫酶旁系。從生物技術(shù)的觀點來看乳酸的生產(chǎn)是非常重要的，因為它可以產(chǎn)生許多自然發(fā)酵的實驗室資源，它可以用在食品，制藥和生物聚合物產(chǎn)業(yè) [7]。最后乳酸菌的發(fā)酵在 ldhL 、 ldhD 雙基因剔除的情況下仍然能夠合成乳酸 [1]。檸檬酸銨 2 克 。 LDH4 的 437 bp 的片段， ampliWed 5ˊ TCTCAATTCAGCGATGGC 和 5ˊ CTACATCATCAGATGCG 和克隆到 EcoRV 消化 pRV300 來給pRVldh4。通過與相應(yīng)的寡核苷酸和 DNA 聚合酶鏈反應(yīng)轉(zhuǎn)化在正確的位點整合測試。 D乳酸和 L乳酸的同分異構(gòu)體的比例來自 RBiopharm 公司的D/Llactic 酸性試劑盒上（德國達姆施塔特公司）。蛋白質(zhì)的頻段為在一個黑暗背景下的清晰條帶證明了 NADH 的氧化酶活性。莖環(huán)代表假 定的轉(zhuǎn)錄終結(jié) 酸）。 LDH4 是位于在 3ˊ肽尾一個丙酮酸 diVerent 亞基編碼基因簇脫氫酶復合體，似乎形成一個操縱子一個保護假設(shè)蛋白和編碼假定基因古型果糖1， 6二磷酸酶的 inositolmonophosphatase 種群。為了產(chǎn)生一個穩(wěn)定的突變并避免抗生素抗性標記的存在， 粒 PRV LDH1，其中進行的 5 和 3 LDH1 Xanking 地區(qū)。此外，結(jié)合 LDH2， LDH3 或 LDH4 突變及 LDH1 缺失沒有產(chǎn)生明確一個總的 eVect 乳酸生產(chǎn)， 雖然， D/Llactate 比例上升超過雙重 LDH1 LDH2 和 LDH1 LDH4 相比單 LDH1 的突變。 A 頻段展現(xiàn)出 D乳酸脫氫酶活性，并為缺失在 hicD突變體被明確檢測（圖 2a），這表明它是產(chǎn)物的 hicD 基因。 BL274（ LDH1hicD） 。圖 3顯示，再次表現(xiàn)出 NADH 的蛋白條帶只能是存在的具有氧化酶的活性的丙酮酸分派給產(chǎn)物 hicD 所致。 BL252（ LDH1 LDH2） 。 LDH1 突變有一個顯著的來自干酪乳桿菌的 eVect 代謝反應(yīng)，盡管 在突變株測得 LDH 的活性偏低，但它仍然產(chǎn)生了相當大數(shù)量的 L乳酸。我們的研究結(jié)果 conWrm 證明了先前的假設(shè)， HicD 負責在 D乳酸水平 LDH1 的情況下 [19]增加。但在先前的一份報告中， hicD的突變導致幾乎測不到 D乳酸水平 [19]。事實上，干酪乳桿菌 LDH1 突變株在通氣條件下增長較快 [19]， BL23 的基因組檢測表明，至少有三個公認的 NADH 的氧化酶（數(shù)據(jù)編碼 未顯示）。ENVIRONNEMENT，在非洲自然資源 ThivervalGrignon，Microbiologie 等 G233。n JL, Monedero V, P233。nez yeast extract, 4 g。C with 5 mM H2SO4 as a solvent and at a Xow rate of mL/min. The proportion of D and Llactate isomers was determined with the D/Llactic acid kit from RBiopharm (Darmstadt, Germany). Glucose present in the growth medium was measured with the DGlucose kit from RBiopharm. Lactate dehydrogenase zymogram assays Lactobacillus casei wildtype and mutant strains were grown in 10 mL of MRS and exponentially growing cells were recovered by centrifugation, washed with Tris–HCl 100 mM pH and resuspended in the same buVer supplemented with 1 mM dithio1,4threitol and mM phenylmethylsulphonyl Xuoride. Cells were broken by shaking with glass beads ( mm diameter) in a MiniBeadbeater (Biospec) and cellular debris was removed by centrifugation 10 min at 12,000￡ g and 4 176。(2) an IS3related insertion element is present in ATCC 334 between lpdA and ldh4。 K2HPO4, 2 g。 Vicente Monedero Received: 21 December 2021 / Accepted: 13 January 2021 / Published online: 30 January 2021 ??Society for Industrial Microbiology 2021 Abstract Lactobacillus casei is a lactic acid bacterium that produces Llactate as the main product of sugar fermentation via Llactate dehydrogenase (Ldh1) activity. In addition,small amounts of the Dlactate isomer are produced by the activity of a Dhydroxycaproate dehydrogenase (HicD).Ldh1 is the main Llactate producing enzyme, but mutation of its gene does not eliminate Llactate synthesis. A survey of the L. casei BL23 draft genome sequence revealed the presence of three additional genes encoding Ldh paralogs. In order to study the contribution of these genes to the global lactate production in this anism, individual, as well as double mutants (ldh1 ldh2, ldh1 ldh3, ldh1 ldh4 and ldh1 hicD) were constructed and lactic acid production was assessed in culture supernatants. ldh2, ldh3 and ldh4 genes play a minor role in lactate production, as their single mutation or a mutation in bination with an ldh1 deletion had a low impact on Llactate synthesis. A _ldh1 mutant displayed an increased production of Dlactate, which was probably synthesized via the activity of HicD, as it was abolished in a _ldh1 hicD double mutant. Contrarily to HicD, no Ldh1, Ldh2, Ldh3 or Ldh4 activities could be detected by zymogram assays. In addition, these assays revealed the presence of extra bands exhibiting D/Llactate dehydrogenase activity, which could not be attributed to any of the described genes. These results suggest that BL23 possesses a plex enzymat