20xx年醫(yī)學專題—第七章哺乳動物胚胎干細胞技術(shù)(文件)
【正文】 S細胞），此項研究成功將干細胞研究擴充到一個新的領(lǐng)域：重編程！ 2007年，iPS研究取得巨大進展：山中亞彌等人和湯姆森帶領(lǐng)下的華裔科學家俞君英等人分別(fēnbi233。 2009年3月，美國白頭研究所（Whitehead Institute）科學家在成功誘導iPS細胞(x236。,四 .胚胎干細胞的分離培養(yǎng)(p233。,第三十八頁，共七十頁。,第三十九頁，共七十頁。nǐ)體內(nèi)胚泡的著床，更接近自然發(fā)育過程，較易獲得胚胎干細胞集落。 此法較為簡單，且去除滋養(yǎng)層細胞較徹底(ch232。滋養(yǎng)層細胞生長并在培養(yǎng)皿底壁上鋪展(pūzhǎn)，而ICM細胞增殖，垂直向上生長，形成卵圓柱狀結(jié)構(gòu)，在顯微鏡下用玻璃針挑出這種柱狀結(jié)構(gòu)，消化傳代。xi224。,第四十四頁，共七十頁。 這些細胞在生長過程中不僅能分泌LIF，同時IGFII等生長因子，能促進ES細胞的生長。)直接添加到囊胚或PGCs的培養(yǎng)液中，分離ES細胞。,小鼠采用超排卵途徑收集(shōuj237。n)交配，陽性者為0天（即0.5dpc）；,第三天至第四天中午（即3.5 dpc－4.5 dpc）分別剖取孕鼠子宮，沖出早期胚泡，進一步分離培養(yǎng)建立ES細胞系；,剖取發(fā)育至8.5 dpc－10.5 dpc時的胚胎，可建立小鼠EG細胞系。iyǎng)過程,基本(jīběn)培養(yǎng)液,DMEM液 15%－20% FCS 0.1mmol/L β－巰基乙醇 50U/ml青霉素、50ug/ml鏈霉素,β巰基乙醇是一種還原劑，其主要作用是降低氧對細胞產(chǎn)生的氧化損傷，體外培養(yǎng)必須抑制自由基的氧化，所以β巰基乙醇是保護蛋白不被自由基氧化的很好的高效的物質(zhì)。)胚泡的ICM細胞，或用常規(guī)培養(yǎng)法分離出ICM細胞進一步培養(yǎng)。)手術(shù)法,4－4.5dpc的小鼠胚泡主要由已分化的滋養(yǎng)外層胚層和未分化的ICM細胞組成，前者細胞表面一般已表達主要組織相容性復合體（MHC），能識別其相應(yīng)抗體和形成免疫復合物，在補體存在(c,體外培養(yǎng)的胚泡，用酸性Tyrode`s液（pH2.5）處理，去除(q249。,30min,胚泡的滋養(yǎng)外胚層細胞呈泡狀，發(fā)生免疫溶解；而ICM細胞不具H－2b抗原，細胞完整；,30min,第五十二頁，共七十頁。nh233。,五.ES細胞(x236。 2.冷凍保存：通過超低溫冷凍保存使細胞的代謝活動完全停止，達到長期保存的目的。 1.形態(tài)：呈克隆狀生長，即單個ES細胞能繁殖呈形態(tài)、功能和遺傳基礎(chǔ)完全相同的一簇細胞，并凝聚成團，外觀形似鳥巢。,第五十五頁，共七十頁。 5.核型分析：傳到2~5代時需要進行核型分析，分析時先在細胞培養(yǎng)液中加入一定濃度的秋水酰胺，使細胞同步在M期，然后用低滲溶液處理，經(jīng)乙醇冰醋酸溶液固定后染色和顯微照相，最后進行核型分析，檢測細胞是否維持在二倍體狀態(tài)。,第五十七頁，共七十頁。qi225。)形成？ 7 倫理之爭,七.ES細胞技術(shù)目前(m249。)，目前對于ES干細胞維持多能性的分子機理缺乏了解，不能根據(jù)細胞分化特點和維持不分化的營養(yǎng)要求，建立合理的培養(yǎng)體系，是目前存在的主要問題。n)的組織相容性抗原將激活免疫系統(tǒng)，出現(xiàn)排斥反應(yīng)，導致移植失敗。nzhěng)的器官 5.人ES細胞分離培養(yǎng)面臨的倫理法律問題 獲得ES細胞，必須毀壞人的早期胚胎或胎兒，與宗教的教義和社會倫理相違背，同時還違反國家法律，所以公眾很難接受。h233。 應(yīng)用嵌合體技術(shù)，以特殊基因標記的ES細胞作為探針，研究未知基因的功能，探討器官的發(fā)生、發(fā)育規(guī)律，將是醫(yī)學、動物科學和發(fā)育生物學研究的前沿(qi225。,4. ES細胞治療(zh236。但是人細胞核移植技術(shù)研究在很多國家(gu243。,6.用ES細胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜 ES細胞易于(y236。,The end,第六十九頁，共七十頁。用外源基因轉(zhuǎn)染后，篩選陽性細胞，然后注入到囊胚腔或其他卵裂球聚合獲得嵌合體后代，用轉(zhuǎn)染的ES細胞分化為生殖干細胞，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因陽性動物。ngzhǐ)，達到長期保存的目的,第七十頁，共七十頁。其中組織培養(yǎng)法是將胚泡接種在飼養(yǎng)層上，模擬體內(nèi)胚泡的著床，更接近自然發(fā)育過程，較易獲得胚胎干細胞集落。ir243。)基因打靶和基因敲除，用遺傳改良后的ES細胞，通過細胞核移植技術(shù)，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因后代，將是提高轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)效率的有效方法。,第六十六頁，共七十頁。o)中的免疫排斥問題,第六十五頁，共七十頁。n)領(lǐng)域。,第六十三頁，共七十頁。,八.ES細胞(x236。,第六十一頁，共七十頁。,第六十頁，共七十頁。n)存在的問題,第五十九頁，共七十頁。,第五十八頁，共七十頁。只有當操作后的胚胎發(fā)育為嵌合體，注入的細胞能分化為內(nèi)、中和外三胚層細胞，并參與細胞生殖干細胞形成時，才能確認為ES細胞。,6.發(fā)育分化潛力： （1）體外誘導分化：是把ES細胞培養(yǎng)在無分化抑制物的普通培養(yǎng)液中，如果ES細胞能自動聚合并分化形成胚狀體，可初步確認具有發(fā)育多能性； （2）畸胎瘤實驗：把ES細胞注射到有免疫(miǎny236。tā)分化的體細胞，可用
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