【正文】 13 、 病毒組裝和釋放 。 首先針對(duì)耐藥突變問(wèn)題，考慮雞尾酒式療法，以?xún)煞N或三種不同作用靶點(diǎn)或機(jī)制的藥物進(jìn)行治療；并且，針對(duì)耐藥突變問(wèn)題，臨床試驗(yàn)顯示組合中需要含有至少一個(gè)高突變門(mén)檻的藥物成分。 建議選取下列化合物做起點(diǎn)，進(jìn)行 HCV 創(chuàng)新藥物項(xiàng)目開(kāi)發(fā)： 核苷類(lèi) HCV 核苷聚合酶 NS5B抑制劑，此類(lèi)抑制劑活性好 、耐藥性好， 并 且比較 廣譜： Sofosbuvir (GS7977) Mericitabine (RG7128) 聯(lián)苯類(lèi)蛋白酶 NS5A 抑制劑，此類(lèi)抑制劑活性極高，并且和其它藥物連用效果較好，然而不耐病毒突變： Daclatasvir (BMS 790052) TLR7 激動(dòng)劑： 15 此類(lèi)化合物也是治療 HBV 潛在藥物 。 NS5A在 HCV復(fù)制和組裝中起到重要作用 ， 還與宿主免疫反應(yīng)有關(guān)， 是一個(gè)比較新穎的靶點(diǎn) ，此類(lèi)藥物大多處在臨床階段，這給我們很多 追趕 機(jī)會(huì) 研發(fā)出中國(guó)自主的丙肝治療藥物 。 二、 NS5A 靶點(diǎn)： NS5A 在 HCV 生命周期 中的復(fù)制 和組裝 階段發(fā)揮作用，如下圖一所示。 17 圖一 NS5A 在 HCV 生命周期中的位置 NS5A 的區(qū)域一（ 1213 殘基）包含一個(gè)鋅離子結(jié)合區(qū)和一個(gè)兩親的氮端螺旋，此螺旋能夠 促進(jìn)膜連接（ membrane association）。 NS5A 區(qū)域一中的 36198 殘基晶體結(jié)構(gòu)顯示其二聚為一個(gè) U 型結(jié)構(gòu)，并且內(nèi)表面排列一系列堿性氨基酸，此氨基酸被認(rèn)為是與病毒 RNA 結(jié)合部位。 B、 D 兩圖顯示區(qū)域一的保守度，一不同顏色表示，品紅色表示 95%，淡粉紅色表示75%95%，白色表示 75%。由 A 和 B圖分析可見(jiàn)，此二聚體在靠近氮端形成了一個(gè)相對(duì)平面的、堿性表面，并在兩個(gè) IB 區(qū)形成了大的溝。 Daclatasvir (BMS790052) 圖四、 NS5A 抑制劑結(jié)構(gòu)。 HCV replicon (pM) EC90 20177。 BMS411 的結(jié)構(gòu)如下圖所示： 23 結(jié)合方式通過(guò) QUANTA軟件模擬，可見(jiàn) BMS411活性狀態(tài)為 γ扭曲形結(jié)構(gòu)，橫穿 NS5A 二聚體的接觸面，其“蓋子”區(qū)靠近 Y93 氨基酸，其核心區(qū)域平躺于氨基酸 L31 殘基之下，氨基酸殘基 Q54 靠近 BMS411 的末端，并與 α螺旋的氨基酸殘基 L28 相接觸。 首先，通過(guò)對(duì)烯烴電子生物等排體的考察，發(fā)現(xiàn)其 所連苯環(huán)傾向于反式共平面結(jié)構(gòu)，而 換成飽和烷基鏈 后活性降低 67 倍， 醚鏈活性 比烷基鏈進(jìn)一步 降低 16倍 ，對(duì)此 ， 進(jìn)行構(gòu) 象 分析，認(rèn)為兩邊的苯環(huán)傾向于共平面或平行排列，而不是處于正交平面 ： 然后，考察鏈的長(zhǎng)短對(duì)活性的影響，發(fā)現(xiàn)將乙烯基置換成亞甲基，羰基，氧，都 會(huì)使 活性極大降低。 有文獻(xiàn)報(bào)道了 BMS790052 聯(lián)苯結(jié)構(gòu) Linker/Core 的構(gòu)效關(guān)系 5。 然而，鹵素取代25 也使在淋巴細(xì)胞上的毒性提高。 同時(shí)，在咪唑上的某些鹵素取代也改善了化合物的藥 藥相互作用問(wèn)題。但是比較 30 與化合物 1，發(fā)現(xiàn)其亞型選擇性不同。 五、創(chuàng)新藥物設(shè)計(jì) 綜合相關(guān)文獻(xiàn)專(zhuān)利， 此類(lèi)化合物的基本形狀是 γ扭曲形結(jié)構(gòu)， Linker/Core為柱狀結(jié)構(gòu)，兩邊為氨基酸，其 γ扭曲通過(guò)環(huán)實(shí)現(xiàn) ，如下圖所示： 27 此類(lèi)化合物的 Linker/Core 的芳環(huán) 結(jié)構(gòu) 給我們留下很大 改動(dòng)余地。 (c) Manns, M.。 Vliegen, I.。 (e) Qiuwei, P.。hler, S.。 (h) Sofia, M., Nucleotide prodrugs for HCV therapy. Antiviral Chem. Chemother 20xx。 therapeutics 20xx, 32 (1), 1428. 2. (a) Tellinghuisen, T.。 Brodsky, O.。 Denis, R. S. L.。 Fukang, Y.。 JinHua, S.。 Nicholas, A. M.。 Min, G.。 Julie, A. L.。 Peter, T. N.。 Michael, H. .。 Xuejie, Y.。 (c) Omar, D. L.。 Michael, H. .。 Amy, S. R.。 Donald, R. O. B.。 Min, G.。 Medicinal Chemistry Letters 20xx, 23。 Min, D.。 Rudolph, G. K.。 Van, N. N.。 Jeffrey, L. R.。 Fukang, Y.。 (e) Belema, M.。 Qiu, Y.。 O39。 Fridell, R.。 Meanwell, N.。 Peter, T. N.。 Jeffrey, L. R.。 Michael, .。 Min, G., Characterizations of HCV NS5A replication plex inhibitors. Virology 20xx. 5. Shi, J.。 Zhang, H.。 Tharnish, P.。 medicinal chemistry letters 20xx, 22 (10), 34883491. 6. Zhang, H.。 Bobeck, D.。 Whitaker, T.。 化合物分類(lèi)依據(jù)其核心結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行。 瑞喹莫德是 TLR7/8 的激動(dòng)劑，作為 HCV 的治療藥物進(jìn)入臨床 Ⅱ a 階段。 9 此化合物被 Coley 公司研發(fā)用作抗腫瘤，是 TLR7 的強(qiáng)效激動(dòng)劑。 目前，相關(guān)專(zhuān)利中對(duì)此類(lèi)化合物的涵蓋范圍如下： 在專(zhuān)利 US20xx245289A110中， 4SC ： 此系列化合物是 TLR7 選擇性激動(dòng)劑，用作腫瘤的治療。 36 Comp R EC50， nM Comp R EC50， nM 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 目前，相關(guān)專(zhuān)利中對(duì)此類(lèi)化合物的涵蓋范圍如下： Pfizer 公司的 US20xx197478A114 、 US20xx039884A11 US20xx302598A116三篇專(zhuān)利。 17此類(lèi)化合物是 TLR7 的強(qiáng)效激動(dòng)劑，并在結(jié)構(gòu)上和39 艾沙托立賓（ isatoribine，后面會(huì)介紹）的堿性部分結(jié)構(gòu)相似。 并且，在雪貂嘔吐模型中，以 30mg/kg給藥 SM276001，仍無(wú)嘔吐反應(yīng)，而瑞喹莫德在比 Cmax 低十倍劑量下仍然劇烈嘔吐， Dainippon Sumitomo 研究人員猜測(cè)可能是由于后者更強(qiáng)的 CNS 透過(guò)能力 。D）的專(zhuān)利，以及相同時(shí)期 Gilead Sciences, ，最后還有少部分 GlaxoSmithKline ，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為都具有相同的中心骨架。D 公司披露了以下結(jié)構(gòu)骨架： 此專(zhuān)利 披露了 7 個(gè)化合物結(jié)構(gòu)，部分活性結(jié)果見(jiàn)下表（ 活性結(jié)果 pEC50 為T(mén)LR7 激動(dòng)劑誘導(dǎo) SEAP（ secreted alkaline phosphatase）產(chǎn)生達(dá)到此化合物最大水平一半時(shí)所需的濃度）。D 公司對(duì)右側(cè)邊鏈末端為酯基的情況進(jìn)行了研究，披露了以下骨架： 此類(lèi)化合物是 TLR7 的激動(dòng)劑，給出了近 70 個(gè)化合物結(jié)構(gòu)。 TLR7 活性報(bào)告 HCVHEK293 Assay IFN PBMC Assay EC50 范圍為 ECmax范圍為 ； Examples A,C,D,F,J,N,R,W,Y,AI,AJ,AQ, AS,AU,AY,AW,AZ,BE,BG,BH,and BM 的 IFN ECmax 值小于 5 nM。 項(xiàng)目 TLR7 活性報(bào)告 HCVHEK293 Assay EC50 范圍為 IFNPMBC Assay ECmax范圍為 ； 部分化合物結(jié)構(gòu)見(jiàn)下表： 編號(hào) 結(jié)構(gòu) 編號(hào) 結(jié)構(gòu) 1 2 3 4 5 6 7 8 56 9 10 11 12 13 14 15 16 Pfizer 公司 US20xx264448A129專(zhuān)利披露了 250 個(gè)化合物結(jié)構(gòu)，骨架如下： 部分活性結(jié)果與結(jié)構(gòu)見(jiàn)下表（ 活性結(jié)果 ED50為 TLR7激動(dòng)劑增加干擾素 IFN釋放從而使 PBL/HCV 復(fù)制水平降低 50%時(shí)的濃度）。其中，艾沙托立賓進(jìn)入到治療 HCV 感染的Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)也具有良好的耐受性，并且能夠有效的產(chǎn)生艾沙托立賓。然而由于最近 Roche 宣布收購(gòu)了 Anadys，此項(xiàng)目前途未卜。 67 據(jù)此合成了以下幾個(gè)化合物（顯示部分）： 編號(hào) 結(jié)構(gòu) 編號(hào) 結(jié)構(gòu) 3i 7 3g 8 9 選擇化合物 3i測(cè)試器 TLR7活性，結(jié)果如下： 項(xiàng)目 活性報(bào)告 TLR7 、 三氮唑類(lèi)（ Triazole） 在專(zhuān)利 WO20xx030996 A139中， Coley Pharmaceutical Group, 了以下兩個(gè)化合物，它們是 TLR7 和 TLR8 的強(qiáng)效激動(dòng)劑。 部分化合物結(jié)構(gòu)見(jiàn)下表： 編號(hào) 結(jié)構(gòu) 編號(hào) 結(jié)構(gòu) 1 2 3 4 5 6 66 7 而在專(zhuān)利 US20xx258928A136， US20xx316327A137 中， Gilead Science, Inc.公司披露了以下兩個(gè)骨架： 此類(lèi)化合物是 HCV 治療藥物的前藥，但在專(zhuān)利中并沒(méi)有提及機(jī)理是否是通過(guò) TLR途徑實(shí)現(xiàn)，然而鑒于其與上述 Anadys 化合物結(jié)構(gòu)的相似性，也將其進(jìn)展列出。隨后，對(duì) ANA975 配方 的進(jìn)一步研究也被終止，由此分析，每日給藥的劑量無(wú)法達(dá)到足夠的治療指數(shù)。艾沙托立賓使病毒載量降低的幅度中等，考慮到相對(duì)較高的給藥劑量，反映出其在 TLR7 受體上較弱的藥理作用（ primary pharmacology），還需要改進(jìn)出更強(qiáng)效的類(lèi)似物。 而在專(zhuān)利 US20xx098294A130中， Dennis A. Carson公司披露了以下骨架： 此類(lèi)化合物是 HCV 治療藥物的前藥，但在專(zhuān)利中并沒(méi)有提及機(jī)理是否是通過(guò) TLR途徑實(shí)現(xiàn)，然而鑒于其與上述 Anadys 化合物結(jié)構(gòu)的相似性，也將其進(jìn)展列出。 而在專(zhuān)利 US20xx098248A127中， Gilead Science, 更深入的研究，披露了以下骨架： 54 此類(lèi)化合物是 TLR7 的激動(dòng)劑，給出結(jié)構(gòu)的 59 個(gè)化合物中多數(shù)化合物的活性（ MEC）接近 1nM。D 公司披露了以下結(jié)構(gòu)骨架： 此專(zhuān)利 披露了約 75 個(gè)化合物結(jié)構(gòu)，部分活性結(jié)果見(jiàn)下表（ MEC， 活性結(jié)果為誘導(dǎo) INF 所需最低濃度）。D 公司對(duì)右側(cè)邊鏈長(zhǎng)度以及形狀進(jìn)行了更深入的研究，披露了以下骨架： 此類(lèi)化合物是 TLR7 的激動(dòng)劑，給出了近 20 個(gè)化合物結(jié)構(gòu)。D 公司披露了以下結(jié)構(gòu)骨架： 46 此專(zhuān)利 披露了 10 個(gè)化合物結(jié)構(gòu)，活性結(jié)果見(jiàn)下表（ 活性結(jié)果 pEC50為 TLR7激動(dòng)劑誘導(dǎo) SEAP（ secreted alkaline phosphatase） 產(chǎn)生達(dá)到此化合物最大水平一半時(shí)所需的濃度）。在 C2 位的功能團(tuán)化也得到 TLR7 強(qiáng)效激動(dòng)劑如 SM360320，在干細(xì)胞中能夠抑制 HCV 復(fù)制。作為已披露的腺嘌呤衍生物的一個(gè)，在小鼠脾細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)以及小鼠體內(nèi)口服實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出強(qiáng)效的IFN 誘導(dǎo)作用。 其中，活性較高的化合物 1 1 7 82 結(jié)構(gòu)分別如下： 編號(hào) 結(jié)構(gòu) 編號(hào) 結(jié)構(gòu) 1 EC50=104nM 2 EC50=107nM 3 4 38 EC50=100nM EC50=127nM 專(zhuān) 利 US20xx039884A115披露了 10 個(gè)化合物結(jié)構(gòu)，部分活性結(jié)果見(jiàn)下表（ 活性結(jié)果 EC50 為 TLR7 激動(dòng)劑增加干擾素 IFN 釋放從而使 PBL/HCV 復(fù)制水平降低 50%時(shí)的濃度）。 項(xiàng)目 活性報(bào)告 IFNα和 TNFα PBMCs 此專(zhuān)利公布約 400 化合物，代表性化合物結(jié)構(gòu)如下表所示： 編號(hào) 結(jié)構(gòu) 編號(hào) 結(jié)構(gòu) 1 2 3 、 8氧 去氮嘌呤（ 8oxodeazapurines）類(lèi) /咪唑并吡啶酮類(lèi)（ Imidazopyridinones） Pfizer 披露了一組強(qiáng)效的 8氧 去氮嘌呤類(lèi) TLR7 激動(dòng)劑， 代表性化合物（ PF4171455） 結(jié)構(gòu)如下圖所示，被開(kāi)發(fā)作為 HCV 治療藥物。此化合物能夠計(jì)量依賴(lài)和給藥頻率依賴(lài)的誘導(dǎo)免疫生物標(biāo)記物和 IFN 反應(yīng)。 隨后對(duì)此類(lèi)化合物進(jìn)行了構(gòu)效關(guān)系研究，得到