【正文】 rhea virus replicon）達到皮摩爾級別 。 BMS0790052等抑制劑的活性雖然達到較理想水平，然而還存在易被病毒突變逃逸、潛在細胞毒性、藥代特性等方面問題有待改進。此非結構蛋白質也參與若干細胞過程，比如干擾素抵抗以及凋亡調節(jié)。目前還沒發(fā)現(xiàn) NS5A 的 酶功能，研究顯示 NS5A 可能通過與其它的 HCV 蛋白或宿主細胞因子相互作用來發(fā)揮功能。區(qū) 域二（ 250342 殘基）起著調節(jié)的功能，比如和蛋白激酶 PKR、 PI3K 以及 NS5B 相作用，并且，此區(qū)域也包含 IFN 敏感性決定區(qū)。 并且，此組裝作用就是通過區(qū)域里的磷酸化作用調節(jié)的。而抗NS5A 抑制劑的突變位點也在 NS5A 的氨基端附近，位于蛋白和膜之間，表明抑制劑可能就結合在二聚體結合 面。 區(qū)域一的分子表面， A、 C 兩圖顯示 區(qū)域一的表面電勢 ， 以不同顏色表示，紅色為酸性，白色為中性， 藍色為 堿性。 19 圖三、 NS5A 區(qū)域一的二聚體 結構 。 B） 二聚體表面電勢分布。 C） NS5A 結構相對內質網(wǎng)膜的位置。 NS5A 抑制劑的代表性化合物是 BMS790052， 已經(jīng)進入 3 期臨床， 結構如下圖，其初步構效關系已被報道 3。 目前 研發(fā)較深入的 NS5A 抑制劑 總結 見表一，大部分化合物的結構沒有披露，但根據(jù)其專利信息，可以發(fā)現(xiàn)都是 BMS790052 的結構類似物。D IRELAND 5 NT 四、 BMS790052(daclatasvir)研究 ： 、 BMS790052 部分活性數(shù)據(jù)： 表三、代表性 NS5A 抑制劑 BMS790052 活性數(shù)據(jù) 項目 數(shù)值 項目 數(shù)值 HCV replicon (pM) EC50 177。 t1/2 (min)(HLM) Elimination rate constant (k) Cytotoxicity, CC50 (μM) PBM 19 Cytotoxicity, CC50 (μM) Vero 21 Cytotoxicity, CC50 (μM) CEM CLint(μL/min/mg protein) CYP1A2 (μM) IC50 100 CYP1A2 (μM) IC90 100 CYP3A4 (μM) IC50 177。 CYP2C9 (μM) IC90 100 Resistance Mutations L31 V 、 BMS790052 的結合位點： BMS790052 的結合位點還未見報道，但其類似物 BMS411 的可能結合位點已被披露 4。 BMS411 與 NS5A 蛋白二聚體結合模式預測圖，黃色棒球 部分代表高耐藥突變殘基。 片段 I 的構效關系 3c： 片段 I 被相當密集的考察過， 在通向 BMS790052 的道路中，對此部分的考察 是通過下面化合物 1 進行的： 24 通過此部分考察發(fā)現(xiàn)此核心結構的平面性、指向、極性、長度都活性影響很大。而延長飽和烷基鏈的鏈長，活性降低程度中等。 同時，雜芳環(huán)的引入也使得某些化合物具備了對 GT1a 的中等程度的抑制活性。 結果顯示，縮短此結構長度 使活性極大降低，而增加長度至三個苯環(huán)活性基本保持，而毒性下降。 片段 II 和片段 III 的構效關系 6： 在片段 II 的咪唑 4位引入噻吩、呋喃或苯基導致活性下降，但引入小基團如氟、氯、溴等后 ， EC50基本不變， 而 EC90 有中等程度提高 。在片段 III 上的取代也表現(xiàn)出類似趨勢，小體積的疊氮取代活性 基本 保持，并且 （ 4R） 疊氮取代 在 PBM、 CEm和 Vero 細胞中沒有表現(xiàn)出任何毒性（ 100μM） ，（ 4S） 疊氮取代表現(xiàn)出毒性（略） 。 將兩個位置最優(yōu)取代結合，得到化合物活性都能保持，并且發(fā)現(xiàn)咪唑溴代的疊氮產物在 Vero 細胞上無毒 性（ 100μM）。 片段 IV 的構效關系 3d, e： 在此處的改造主要為提高在 GT1a 上的抑制活性，對此部分的考察 是通過下面化合物 3 進行的： 首先發(fā)現(xiàn)， 去除乙基， 在 GT1a 上的活性降低，但兩個化合物 苯甲酰胺和苯胺 環(huán)的二面角 大小 基本 相同 ，說明原化合物的 GT1a 上活性的提高不是鄰位取代引起的空間 效應 所致 ?；诖?，對一系列含氮雜環(huán)進行了篩選，發(fā)現(xiàn)異喹啉甲酰胺表現(xiàn)出與原來預測相一致的活性，即：其結構是有 GT1b 高活性的苯乙酸和有 GT1a 高活性的苯甲酸的融合，而確實兼具了兩者的優(yōu)勢，如下圖所示， 鑒于此，對此類結構進行了詳細考察，主要考察取代基的影響，發(fā)現(xiàn) 取代基效應非常明顯，兵器最終得到了雙取代化合物 30（結構略），不僅在 GT1 兩個亞型上表現(xiàn)強的抑制活性，在 G2a JFH（ EC50 = nM）、 G2a NIH（ EC50 = 14nM）、G3a（ EC50 = nM）和 G5a hybrid（ EC50 = nM）也表現(xiàn)出強的抑制活性。而比較 30 與化合物 3 苯甲酰胺和苯胺環(huán)的構想， 發(fā)現(xiàn)相差很大，推測，可能化合物 3 的構象與 NS5A GT1b的生物構象較符合，而 30 則與 NS5A GT1a 的較符合。 進一步考察中為避免烯烴順反互變帶來的影響，將烯烴置換為炔鍵，主要進行甘氨酸類 多樣性考察 : 發(fā)現(xiàn)此處化合物活性隨著取代基堿性的減弱而降低，并得到活性進一步提高的化合物 。 據(jù)此， 我們初步設計以 了第一階段工作計劃，先合成以 下幾種 Linker/Core 的化合物，之后再選擇活性較好的結構進行進一步環(huán)以及氨基酸部分改造 ： 并 三 環(huán)類 : 四元環(huán)類： 28 其它類： 29 參考文獻： 1. (a) Pawlotsky, ., Therapy of hepatitis C: from empiricis m to eradication. Hepatology (Baltimore, Md.) 20xx, 43 (2 Suppl 1), 20。 Rice, C., Understanding the hepatitis C virus life cycle paves the way for highly effective therapies. Nature medicine 20xx, 19 (7), 837849。 von Hahn, T., Novel therapies for hepatitis C one pill fits all? Nature reviews. Drug discovery 20xx。 Neyts, J.。 Abrignani, S.。 De Francesco, R., Hepatitis C virusspecific directly acting antiviral drugs. Current topics in microbiology and immunology 20xx, 369, 289320。 Luc, J. W. v. d. L., New targets for treatment against HCV infection. Best Practice amp。 (f) B252。 Bartenschlager, R., New targets for antiviral therapy of chronic hepatitis C. Liver international : official journal of the International Association for the Study of the Liver 20xx, 32 Suppl 1, 916。 Sarrazin, C., New HCV therapies on the horizon. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 20xx, 17 (2), 122134。 (i) Lange, C.。 Zeuzem, S., Review article: specifically targeted antiviral therapy for hepatitis C a new era in therapy. Alimentary pharmacology amp。 Marcotrigiano, J.。 (b) Love, R.。 Hickey, M.。 Cronin, C., Crystal structure of a novel dimeric form of NS5A domain I protein from hepatitis C virus. Journal of virology 20xx, 83 (9), 43954403. 3. (a) Jeffrey, L. R.。 John, E. L.。 Michael, H. S. W.。 Min, G.。 Julie, A. L.。 Peter, T. N.。 Milind, S. D.。 Lawrence, B. S., Inhibitors of HCV NS5A: From Iminothiazolidinones to Symmetrical Stilbenes. ACS Medicinal Chemistry Letters 20xx, 2。 Makonen, B.。 Jason, G.。 Jay, O. K.。 Mengping, L.。 Van, N. N.。 Donald, O. B.。 Jeffrey, L. R.。 JinHua, S.。 Fukang, Y.。 Nicholas, A. M.。 Medicinal Chemistry Letters 20xx, 22。 Van, N. N.。 Makonen, B.。 Jason, T. G.。 Yuping, Q.。 Peter, T. N.。 Mengping, L.。 JinHua, S.。 Julie, A. L.。 Andrew, C. G.。 Lawrence, B. S., HCV NS5A replication plex inhibitors. Part 3: discovery of potent analogs with distinct core topologies. Bioanic amp。 (d) Denis, R. S. L.。 Makonen, B.。 Hua, F.。 Jason, T. G.。 Julie, A. L.。 Omar, D. L.。 Peter, T. N.。 Bradley, C. P.。 Lourdes, V.。 YingKai, W.。 Xuejie, Y.。 Lawrence, B. S., HCV NS5A Replication Complex Inhibitors. Part 4.(1) Optimization for Genotype 1a Replicon Inhibitory Activity. Journal of Medicinal Chemistry 20xx。 Nguyen, V.。 Lopez, O.。 Good, A.。 Valera, L.。Boyle, D.。 Liu, M.。 Lemm, J.。 Knipe, J.。 Snyder, L., HCV NS5A replication plex inhibitors. Part 5: Discovery of potent and pangenotypic glycinamide cap derivatives. Bioanic amp。 JinHua, S.。 Julie, A. L.。 Chunfu, W.。 Makonen, B.。 Denis, R. S. L.。 Lawrence, B. S.。 David, R. 30 L.。 Zhou, L.。 Bobeck, D.。 Liu, P.。 McBrayer, T.。 Whitaker, T.。 Schinazi, R., Synthesis and biological evaluation of new potent and selective HCV NS5A inhibitors. Bioanic amp。 Zhou, L.。 Shi, J.。 Tao, S.。 Tharnish, P.。 Coats, S.。 medicinal chemistry letters 20xx, 22 (14), 48644868. 31 第三章 TLR7 激動劑研究與設計 一、 目前已開發(fā)的激動劑 主要參考文獻來自 20xx 與 20xx 年的兩篇綜述 7。 、 咪唑喹啉胺（ imidazoquinoline amine）類 咪喹莫德（ Imiquimod）在 1980 年代由 3M Pharmaceuticals 公司前身 Riker Laboratories 作為抗菌劑開發(fā)， 1997 年被批準用作治療局部 乳頭狀瘤病毒感染 。它們的結構下圖所示： 咪喹莫德是 TLR7 的選擇性激動劑，但有報道其 有強烈催吐副作用 8。以，每周兩次，連續(xù)四周，在此計量水平下化合物能被很好的耐受，但是