6流式細(xì)胞術(shù)的質(zhì)量控制和影響因素(文件)
【正文】 細(xì)胞懸液熒光染色的質(zhì)量控制 單細(xì)胞懸液樣品熒光染色對流式定量分析的精度很重要。因此，影響了熒光分子發(fā)光量子產(chǎn)額 ⒈ 溫度對熒光染色強(qiáng)度的影響： 溫度升高時，熒光減弱，熒光減弱的百分比稱溫度系數(shù)。如果單獨(dú)作DNA倍體分析而不作細(xì)胞周期的處理，小于 1萬個細(xì)胞也可以，但異倍體細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的 10%以下時，不可盲目下結(jié)論，至少異倍體細(xì)胞占總細(xì)胞的 20%以上，可以確定異倍體的存在 正常二倍體細(xì)胞組方圖的 CV值大于8%以上，應(yīng)放棄細(xì)胞周期的分析，但腫瘤細(xì)胞 CV值大于 8%，這與腫瘤細(xì)胞DNA異質(zhì)性增大有關(guān)。對于這樣峰位，除了可用計算機(jī)軟件加以消除外，可放棄 S期的計算 DNA倍體標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量控制： DNA倍體的標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)正常二倍體細(xì)胞DNA含量的分布范圍而確定的，對于二倍體的標(biāo)準(zhǔn)的選擇，應(yīng)遵照如下原則： ◆采用同個體同源正常組織。 ◆同樣的儀器檢測條件。 假性異倍體出現(xiàn)的原因主要有組織自溶造成或在組織固定前或期間，細(xì)胞DNA出現(xiàn)變性 (而非降解階段 )，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變性，與熒光染料結(jié)合增加或減少，更多出現(xiàn)在異倍體細(xì)胞數(shù)僅占總測細(xì)胞數(shù)的 510%的情況下 對于二倍體為主峰的右側(cè)出現(xiàn)的異倍體峰，用 %胃蛋白酶或 1%的 DNA酶消化 35分鐘，如果再測仍然出現(xiàn)異倍體峰可為真性異倍體，如果異倍體峰消失，則認(rèn)為是假性異倍體。 ③細(xì)胞重疊和凝集團(tuán)塊。 3設(shè)對照樣品，與抗體來源的同型對照和熒光抗體的本底對照 對于需要保存不能馬上進(jìn)行定量分析的標(biāo)本，在免疫熒光染色后，不固定可以在 4℃ 放置 48小時不出現(xiàn)熒光強(qiáng)度或標(biāo)記陽性率降低。 解決這些影響因素的方法： 1 使動物血清蛋白等封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，熒光抗體染色后充分洗滌。 八、流式免疫學(xué)檢測的質(zhì)量控制 在免疫熒光染色過程中常出現(xiàn)一些人為非特異性熒光，造成本底熒光過高，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，常見的原因有： ①降低抗體非特異性結(jié)合的措施不夠。 ◆ 在不具備同個體，同源組織的情況下，可以使用雞紅細(xì)胞，或其他生物細(xì)胞為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，作為計算倍體的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞，但這種標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞的使用，僅限于新鮮組織倍體的判定，對于石蠟包埋組織倍體標(biāo)準(zhǔn)，解決的辦法是將正常組織與腫瘤組織同時包埋于一個石蠟組織塊中，這樣正常組織作為一個二倍體內(nèi)標(biāo)準(zhǔn) ,能減少 DNA倍體分析的誤差。 ◆相同的樣品處理方法。大量報道認(rèn)為， S期有明顯的臨床預(yù)后意義，但 S期計算方面容易產(chǎn)生誤差 ,而造成評價 S期在腫瘤生物學(xué)行為不確切性 對于 S期細(xì)胞計算較準(zhǔn)確的方法，就是分別作兩次樣品的檢測，加入 DNA倍體標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測一次，不加二倍體標(biāo)準(zhǔn)的樣品檢測一次， G0/1峰應(yīng)是一個正態(tài)分布(或稱高斯分布 )。因此在熒光測定時要保持染色后的樣品在適當(dāng)?shù)蜏丨h(huán)境下運(yùn)行，盡可能減少樣品的照射時間，有條件時應(yīng)使樣品觀察室做到恒溫裝置，會得到更好的熒光定量結(jié)果 接比例關(guān)系：
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