基因功能分析的基本策略課件(文件)
【正文】 關(guān)的抗病毒體系。 siRNA 與 shRNA ? 30bp siRNA 可以誘導(dǎo) RNAi，并克服哺乳細(xì)胞的障礙。 ?采用多個(gè) siRNA 片段 ，并篩選其中最有效的。 shRNA 與 siRNA 應(yīng)用的局限 ?在某些細(xì)胞的特定狀態(tài)下， shRNA 或 siRNA 仍能夠誘發(fā)細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)。 shRNA 與 siRNA 的比較 ?siRNA ?應(yīng)用非常方便，干擾效力往往比較高。 ?可以進(jìn)行 穩(wěn)定 的基因表達(dá)抑制。 :23:0012:23Feb2326Feb23 1故人江海別，幾度隔山川。 2023年 2月 下午 12時(shí) 23分 :23February 26, 2023 1行動(dòng)出成果，工作出財(cái)富。 12:23:0012:23:0012:232/26/2023 12:23:00 PM 1成功就是日復(fù)一日那一點(diǎn)點(diǎn)小小努力的積累。 2023年 2月 26日星期日 下午 12時(shí) 23分 0秒 12:23: 1楚塞三湘接，荊門(mén)九派通。 , February 26, 2023 閱讀一切好書(shū)如同和過(guò)去最杰出的人談話。勝人者有力，自勝者強(qiáng)。 2023年 2月 26日星期日 12時(shí) 23分 0秒 12:23:0026 February 2023 1一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。 2023年 2月 26日星期日 下午 12時(shí) 23分 0秒 12:23: 1最具挑戰(zhàn)性的挑戰(zhàn)莫過(guò)于提升自我。 :23:0012:23Feb2326Feb23 1越是無(wú)能的人，越喜歡挑剔別人的錯(cuò)兒。 2023年 2月 26日星期日 12時(shí) 23分 0秒 12:23:0026 February 2023 1空山新雨后，天氣晚來(lái)秋。 12:23:0012:23:0012:23Sunday, February 26, 2023 1不知香積寺，數(shù)里入云峰。 下午 12時(shí) 23分 0秒 下午 12時(shí) 23分 12:23: 沒(méi)有失敗，只有暫時(shí)停止成功！。 :23:0012:23:00February 26, 2023 1他鄉(xiāng)生白發(fā)，舊國(guó)見(jiàn)青山。 , February 26, 2023 雨中黃葉樹(shù)，燈下白頭人。 在線蟲(chóng)和植物， siRNA 可擴(kuò)增，但哺乳細(xì)胞不能。 ?在有 14bp 匹配的情況下就能夠誘發(fā)干擾。 ?盡可能使用較低的 siRNA 濃度，以保證其特異性。 shRNA 表達(dá)載體系統(tǒng) miRNA 表達(dá)載體系統(tǒng) siRNA 設(shè)計(jì)原則 ?siRNA antisense 鏈 5’ 端穩(wěn)定性較低時(shí)具有更好的效率。 ?在胚胎期細(xì)胞，上述非特異的抗病毒體系尚未形成。 ?dsRNA 對(duì)蛋白質(zhì)的合成產(chǎn)生影響。 ?同源 mRNA 翻譯受阻。 RNA 干擾 ?RNA 干擾 ：雙鏈 RNA 誘導(dǎo)的同源 mRNA 降解 。 Hela 細(xì)胞：經(jīng) ORC6 siRNA 作用后，細(xì)胞出現(xiàn)多核現(xiàn)象 。 ?很少量的雙鏈 RNA 就能誘發(fā) C. elegans 整體的基因沉默，甚至能傳遞到子一代。 ?外源基因不但不能加深花的顏色，反而造成內(nèi)源基因表達(dá)的降低。 基因敲除和 RNA 干擾 ?基因敲除是在基因水平將某個(gè)基因定點(diǎn)去除，動(dòng)物整體水平。 打靶載體的正篩選 tk1 HB1 neor HB2 tk2 載體 載體 同源重組 neor G418正篩選，細(xì)胞存活 染色體 染色體 打靶載體的負(fù)篩選 tk1 HB1 neor HB2 tk2 染色體 染色體 非特異性整合 GCV負(fù)篩選，細(xì)胞死亡 PCR 鑒定 ?在打靶載體的 HB1 和 HB2 之間，加上一個(gè)載體和鼠的基因組中都沒(méi)有的獨(dú)特 DNA 序列（ US）。 1. 打靶載體的構(gòu)建 同源基因片段 質(zhì)粒載體 HB1 HB2 neor基因 HSVtk基因 2. 打靶載體導(dǎo)入 ES細(xì)胞 ? 磷酸鈣 DNA 共沉淀法 ? 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法 ? 電穿孔法 ? 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法 ? 顯微注射法
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