【正文】 ,在黑色背景下觀察其凝集反應。 如為陽性結果以單“ O”血清進一步進行分群試驗。和高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基也置于室溫下經(jīng)過 24 小時后觀察其菌落形態(tài)，對培養(yǎng)基上長出的圓形、光滑、隆起的金黃色菌落 ,染色鏡檢鑒定葡萄球菌。霉菌瓊脂培養(yǎng)基置于室溫下再經(jīng)過 24 小時記數(shù)霉菌數(shù)；高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基也置于室溫下經(jīng)過 24 小時后觀察其菌落形態(tài)，對培養(yǎng)基上長出的圓形、光滑、隆起的菌落染色鏡檢鑒定葡萄球菌。 :滅菌鹽水、液泵、記號筆、試管架、塑料桶等。 稀釋 : 在無菌室內(nèi)將全部試管蓋兒打開 ,每管內(nèi)加入 4 毫升滅菌鹽水 ,浸泡 510 分鐘。 傾注培養(yǎng)基 : 將水浴鍋中冷卻到 4852℃的 NA、 Mac、 MSA、 MM 四種液體培養(yǎng)基分別傾注到四組平皿中，每種培養(yǎng)基傾注一組，每個平皿 15 毫升，傾注后搖勻冷卻。觀察其菌落形態(tài)是否有可疑沙門氏菌落 ,若有無色半透明 。 表 1 三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基篩選 三糖鐵瓊脂 賴氨酸脫羧酶 初步判斷 斜面 底層 產(chǎn)氣 硫化氫 K A +() +() + 可疑沙門氏菌屬 K A +() +() _ 可疑沙門氏菌屬 表 2 三糖鐵瓊脂和尿素酶瓊脂篩選 三糖鐵瓊脂 尿素酶 瓊 脂 初步判斷 斜面 底層 產(chǎn)氣 硫化氫 K A +() +() _ 可疑沙門氏菌屬 A A +() +() _ 可疑亞 利桑那菌屬 注 ： K:產(chǎn)堿 。 生化試驗結果符合表 3 沙門氏菌特性的按 進行。 用沙門氏診斷血清做進一步的血清學鑒定 . 對無自凝性的培養(yǎng)物 ,先以多價“ O”血清代替生理鹽水 ,在 2 分鐘內(nèi)判斷 結果。不同的曲霉分生孢子的顏色不一樣 ,有黃、蘭、青、黑綠、棕等色；鐮孢酶的菌絲有隔 ,產(chǎn)生在菌絲孢子上的分生孢子 ,大分生孢子呈鐮刀狀 ,有的呈豆角狀。 ： 培養(yǎng)基 : A:營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 (NA.)、 B:麥康凱瓊脂培養(yǎng)基 (Mac.)、 C:高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基 (MSA.)、 D:霉菌瓊脂培養(yǎng)基 (MM.)、 E:沙門氏志賀氏瓊脂培養(yǎng)基 ()、 F:四硫磺酸鈉增菌液 (TTB.)、 G:三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基、 H:賴氨酸鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基、 I:尿素及其它常見生化試驗管、 I:沙門氏菌屬血清、 器械 (皿 ): 18mm 180mm玻璃試管、 2 毫升吸管、 10 毫升吸管、直徑 90mm平皿等。 標號 :稀釋、加樣前先將水瓶上的編號標記在平皿底上 ,每個水樣使用 6 個平皿。 分組 :加樣完畢 ,將用于傾注 NA、 Mac、 MSA、 MM 的平皿分成 4 組放置。營養(yǎng)瓊 脂培養(yǎng)基記數(shù)所有菌落為總菌數(shù)；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基記數(shù)粉紅色菌落數(shù)，通過生化鑒定大腸桿菌 。倘有 2 個稀釋度的菌落數(shù)均在 30300 之間 (1).大小之比〈 2,取平均值，例如 ,10 10 103三個稀釋度的平皿上 , 菌落數(shù)分別為 28 3 6，則總菌數(shù)計為 (285 101+37102)/2= 103。 ：工作間籠頭、水箱、送水管、飲水器（或乳頭飲水器）等各部位選點，檢驗程序同孵化場水樣。 :向水浴鍋內(nèi)加入自來水適量 ,溫度調至 55℃。 標號 :稀釋、加樣前先要將三角瓶上的編號標記在平皿上 ,每份墊料使用 6 個平皿。 分組 :同水樣。 檢驗標準 : 總菌數(shù) 105 總菌數(shù) 108 新 大腸桿菌 0 舊 墊 葡萄球菌 0 墊 料 沙門氏菌 0 料 沙門氏菌 0 綠膿 桿菌 0 霉菌 103 三 . 消毒劑及其使用效果的測定 1. 消毒劑殺菌效果測定（質檢） 試驗材料 : :由廠家提供或從市場購入。 :15mm 180mm滅菌試管； 2ml、 5ml、 10ml 滅菌吸管；移液泵；天平；酒精燈等。 、匍萄球菌、沙門氏菌及綠膿桿菌的懸液 5ml,同時向各管中加入 10%雞糞 1 毫升 ,以消除實驗誤差 ,因生 產(chǎn)實 踐中有機物對消毒效果有影響。培養(yǎng) 24 小時后記錄大腸桿菌的生長情況， 48 小時后記錄匍萄球菌、沙門氏菌及綠膿桿菌的生長情況。 : :250ml 滅菌采水瓶 。 :營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、高鹽甘露醇瓊脂、霉菌培養(yǎng)基。 1ml 消毒液加入上述 4 塊平皿內(nèi)。 : 如總菌數(shù)超過 10 個 , 或有致病菌的存在 , 則認為其已無消毒作用，應換以新配制的消毒液。具體檢測方法如下。 接種：用稀釋度為 106至 1010的疫苗液經(jīng)尿囊腔接種雞胚，每個稀釋度接種 5 枚，每胚 。收獲尿囊液并做 HA 試驗。 二、 IB 疫苗檢測程序 雞胚處理：取 911 日齡 SPF 的雞胚 27 枚 ,照蛋 ,標記，消毒，打孔。 照蛋和收獲：雞胚在 37℃條件下孵育 7 天 ,每天照蛋 ,棄去接種后 24 小時內(nèi)死亡的雞胚 ,收獲死亡胚 ,標記日期 ,存放于 4℃冰箱中。作出疫苗檢測報告。測定程序如下： 按疫苗的頭份數(shù)用稀釋液或 PBS 復蘇疫苗至使用濃度。 照蛋和收獲：雞胚在 37℃條件下孵育 7 天。打開所有雞胚 ,觀察 IBV 引起的特征性病變。 四、 MD 疫苗檢測程序 MD 疫苗的復蘇：準備好一個盛有 37℃水的燒杯。 101及 102稀釋度各接種 3 瓶，留 2 瓶細胞做對照。加入含 1%瓊脂 ,5%犢牛血清的 199。作出疫苗檢測報告。將 107，108及 109稀釋度各接種 3 瓶，留 2 瓶細胞做對照。 結果判定：計算每瓶的空斑數(shù)。 （ 2）碘溶液：碘片 6 克，碘化鉀 5 克，蒸餾水 20 毫升。 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 （ 1）成分：營養(yǎng)肉湯（市面有售）。 ％氯化鈉溶液 （ 1）成分：氯化鈉 90 克，蒸餾水 1 萬毫升。 磷酸鹽緩沖液（ PBS） （ 1）成分：氯化鈉 8 克，氯化鉀 克，磷酸二氫鉀 克，磷酸氫二鈉 克。 飽和鹽水 （ 1）成分：氯化鈉、蒸餾水。 （ 2） 制法：先用 1 公斤水熱水，將重酪酸鉀溶解后，然后放入溫水 19 公斤即可。 二、固體培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 （ 1）成分：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（市面有售）。 （ 2）制法：取滅菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 100 毫升，加熱溶化，待冷至 50℃時，以無菌手續(xù)加入脫纖血 10 毫升，輕輕搖勻，傾注于滅菌平皿中，經(jīng)無菌檢查后，即可放入冰箱中保存?zhèn)溆谩? （ 2）制法：按 克 /100ml 比例，加入到蒸餾水中，混勻，加熱溶解。冷卻到 60℃左右即可傾入平板凝固后，保存于冰箱備用。 （ 2）制法：將上述成分混勻，加熱溶解，分裝試管 5－ 7 毫升， 8 磅壓力，滅菌 20 分鐘，趁熱制成使底層成柱狀，上層斜面，凝固后使用。 葡萄糖瓊脂 （ 1）成分：市售葡萄糖瓊脂 ，蒸餾水 100ml。 （ 2）制法：先將瓊脂粉加入蒸餾水中，加熱溶解。 PH 為 。 （ 2）制法：先將瓊脂粉放入蒸餾水中，加熱溶解。趁熱放入磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、 1％硫柳汞 5ml，攪均后待冷至 60℃傾注平板，每板 20 毫升，厚為 3mm。每板厚為 3mm， 20ml。 磷酸鹽瓊擴板 (PH=) （ 1）成分：磷酸氫二鈉 克（有水 克），磷酸二氫鉀 克，瓊脂 克，氯化鈉 40 克， 1％硫柳汞 5ml。 （ 2）制法：將蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂和蒸餾水混合后加熱溶解，校正 PH 至177。 本培養(yǎng)基均勻高壓滅菌或加熱時間過長。 沙門氏菌志賀氏菌瓊脂（ SS 瓊脂） （ 1）成分： SS 瓊脂（市面有售） 克，蒸餾水 100 毫升。此外加入血液后，要輕輕搖勻，防止產(chǎn)生氣泡。取出后放水浴鍋中待冷至 50－ 55℃，傾注平板，涼后倒置備 用。 （ 2）制法：先用開水 3700 毫升，將重酪酸鉀充分溶解，再緩緩的將硫酸倒入，邊倒邊攪勻，然后放入較為堅固耐溶器內(nèi)。直到食鹽不再溶解為止，在室溫下冷卻，裝瓶備用，如溶液中出現(xiàn)結晶沉淀，為飽和溶液。 保存 液 （ 1）成分：葡萄糖 克，檸檬酸鈉 克，檸檬酸 克，氯化鈉 克，蒸餾水1000 毫升。用氫氧化鈉調 ，分裝入瓶在 15 磅壓力下滅菌 20 分鐘。 緩沖蛋白胨水（ BP） （ 1）成分：蛋白胨 10 克，氯化鈉 5 克，磷酸氫二鈉 9 克（無水 克），磷酸二氫鉀 克；蒸餾水 1000ml。 121℃高壓滅菌 15 分鐘備用。作出疫苗檢測報告。 鋪第一層營養(yǎng)瓊脂：傾去病毒液 ,加入含 1%瓊脂 ,5%犢牛血清的 199，培養(yǎng) 48 小時。用含青霉素 G 鉀 100IU/ml，硫酸鏈霉素 100ug/ml 的 PBS 將疫苗再作 10 倍系列稀釋 (101至 109)。 結果判定：計算每瓶的空斑數(shù)。傾去病毒液 ,向細胞瓶中加入含 2%犢牛血清的維持液，繼續(xù)培養(yǎng) 24 小時。 MD 疫苗的稀釋：將復蘇后的疫苗用稀釋液至使?jié)舛?，再含青霉?G 鉀100IU/ml，硫酸鏈霉素 100ug/ml 的 PBS 把疫苗 10 倍系列稀釋 (101至 102)。用 ReedMuench法計算疫苗的毒價 (EID50/Dose)。 判定結果：孵育 7 天后看結果。 在滅菌試管內(nèi)，用含青霉素 G 鉀 100IU/ml，硫酸鏈霉素 100ug/ml 的 PBS 把病毒與血清的混合液作 10 倍系列稀釋 (101至 107)。其中單價苗 NDV 的毒價測定同常規(guī)的 ND 疫苗測定。打開所有雞胚，觀察 IBV 引起的特征性病變，計算每個稀釋度的累計感染胚數(shù)。 疫苗的稀釋：用含青霉素 G 鉀 100IU/ml，硫酸鏈霉素 100ug/ml 的 PBS 將使用濃度的疫苗作 10 倍 系列稀釋 (101至 107)。計算每個稀釋度的累計死亡數(shù) ,用 ReedMuench 法計算疫苗的毒價(EID50/Dose)。收獲死亡胚，標記日 期，存放于 4℃冰箱中。 疫苗的復蘇：按疫苗的頭份數(shù)用稀釋液或 PBS 復蘇疫苗至使用濃度。現(xiàn)檢測的疫苗主要有： ND， IB， ND+IB， MD，IBD。 分別澆于上述 4 塊平皿內(nèi) ,輕搖使其混勻。 ,然后移入無菌室。2ml 滅菌吸管 。 . 結果與結論 : 在正常使用濃度下，作用 5 分鐘，對大腸桿菌、葡萄球菌、沙門氏菌及綠膿桿菌的殺滅率應達百分之百。 :對每個時間段的四種致病菌以蒸餾水代替消毒液重復上述試驗即為各種菌對照。 :將麥康凱瓊脂 (Mac)、高鹽甘露醇瓊脂 (MSA)、沙門氏志賀氏瓊脂()、營養(yǎng)瓊脂 (NA)各取一塊為一組，每組 為一個時間段，根據(jù)消毒劑稀釋度的數(shù)量配成七組，將每塊板底面用記號筆分成 6 等分，分別在每個等分區(qū)內(nèi)寫明消毒劑各稀釋度及細菌對照的代號。 :麥康凱瓊脂 (Mac)、高鹽甘露醇瓊脂 (MSA)、沙門氏志賀氏瓊脂 ()、營養(yǎng)瓊脂 (NA)、營養(yǎng)肉湯 (NB)。 培養(yǎng) :同水樣。 稀釋、加樣 : A:在試管架擺上多組試管，每組 2 個，每份墊料占用一組，每個試管內(nèi)加入 9 毫升滅菌鹽水。 詳見樣品 采集方法中墊料采集一項 檢驗： 登記、編號 :接到樣品后，首先根據(jù)送檢單對其進行清點 ,同時將所有樣品進行化驗室統(tǒng)一編號 ,并用記號筆標在相應的三角燒瓶上進行稱樣。 : 培養(yǎng)基 : A:營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 (NA.)、 B:麥康凱瓊脂培養(yǎng)基 (Mac.)、 C:高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基 (MSA.)、 D:霉菌瓊脂培養(yǎng)基 (MM.)、 E:沙門氏志賀氏瓊脂培養(yǎng)基 ()、 F:四硫磺酸鈉增菌液 (TTB.