基因工程6重組體克隆的篩選與鑒定(文件)
【正文】 烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影進行分析。 雜交釋放轉(zhuǎn)譯法（ HRT） 這種方法又稱雜交選擇的轉(zhuǎn)譯篩選法，是一種更為敏感的方法，而且可以檢出低豐度的mRNA（占總 mRNA的 1‰ ），它與阻斷轉(zhuǎn)譯雜交的原理相似。由于質(zhì)粒DNA的電泳遷移率是與其分子量大小成比例的，根據(jù)在凝膠中遷移速度的差別，即可鑒定出含有外源 DNA插入序列的重組體菌落。 如果插入片段是大小相近的非目的基因片段，對于這樣的假陽性重組體，電泳法仍不能鑒別，只有進一步用 Southern blot雜交，即以目的基因片段制備的放射性探針和電泳篩選出的重組體 DNA雜交，才能最終確定真陽性重組體。蛋白質(zhì)用聚丙烯酰胺凝膠進行電泳并染色。 R環(huán)結(jié)構(gòu)一旦形成就十分穩(wěn)定，而且可以在電子顯微鏡下觀察到。然后在電子顯微鏡下觀察，便可以檢測出重組體質(zhì)粒的 DNA分子。 根據(jù)這樣的原理，在有利于形成 R環(huán)的條件下，使待檢測的純化的質(zhì)粒 DNA，在含有mRNA分子的緩沖液中進行局部地變性。 R環(huán)的形成是因為：在 70%甲酰胺溶液中，當(dāng)接近 DNA變性溫度時，雜交雙鏈 DNARNA分子比雙鏈 DNADNA分子更穩(wěn)定。Northern blot: 類似于 Southern blot的 RNA分子雜交技術(shù) , 與 Southern blot的主要區(qū)別是在變性劑的存在下，將瓊脂糖凝膠上的 RNA 片段按照原有順序轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上，然后與 P32標記的 RNA探針雜交，用放射自顯影確定雜交帶。因為由這些轉(zhuǎn)化菌落分離的質(zhì)粒 DNA分子的大小各不相同：和真正的陽性重組體 DNA比較，前三種重組 DNA分子較小，在電泳時的泳動率較快，其 DNA帶的位置跑在陽性重組 DNA帶的前面；后兩種重組 DNA分子較大，泳動率較慢，其 DNA帶的位置跑在陽性重組 DNA帶的后面。 物理篩選法 凝膠電泳篩選法 帶有插入片段的重組體在分子量上會有所增加，因而一種直截了當(dāng)?shù)姆椒ㄊ欠蛛x質(zhì)粒的DNA并測定其分子長度。根據(jù)這種目的基因編碼的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯抑制作用，就可篩選出含有目的基因的重組體質(zhì)粒的大腸桿菌菌落群體或噬菌體群體。 雜交阻斷轉(zhuǎn)譯法（ HART） 這種方法又稱雜交抑制的轉(zhuǎn)譯篩選法，其依據(jù)的原理是：在體外無細胞的轉(zhuǎn)譯體系中，mRNA一旦同 DNA分子雜交之后，就不能夠再指導(dǎo)蛋白質(zhì)多肽的合成，即 mRNA的轉(zhuǎn)譯被抑制了。如果有某些菌落的細胞能夠分泌出目的基因編碼的蛋白質(zhì)，它們就會同包含在瓊脂培養(yǎng)基中的抗體發(fā)生反應(yīng)，形成沉淀素圈。把生長著待檢測菌落的原培養(yǎng)基平板，影印到加有抗體的瓊脂平板上，等到影印平板中的菌落長到肉眼可以辨認的大小時，將培養(yǎng)溫度上升到 42℃ ，經(jīng)過 1 h之后，平板中就會有許多細胞被熱誘導(dǎo)發(fā)生溶菌作用。其做法是：在生長菌落的瓊脂培養(yǎng)基中，加入專門抗這種蛋白質(zhì)分子的特異性抗體。 對于能夠分泌表達產(chǎn)物的重組體克隆，可以省去影印平板、裂解菌落等程序，操作更為簡化。這些方法最突出的優(yōu)點是，它們直接檢測重組克隆所表達的蛋白產(chǎn)物，能夠檢測無任何可供選擇的表型特征的重組克隆。最常用的工具酶是辣根過氧化物酶（ HRP）和堿性磷酸酶（ AP）。光敏基團可在光照下活化，與核酸的堿基結(jié)合，連接臂可以降低生物素基團對核酸雜交的空間位阻；生物素用做標記物。一個密碼子： Met（甲硫氨酸） AUG Try （色氨酸） UGG二個密碼子： Cys（半胱氨酸） His （組氨酸） Phe （苯丙氨酸） Try （酪氨酸） Lys （賴氨酸） 2. 非放射性探針 由于 32P放射性同位素半衰期只有 ，不易保存，且對人體有一定的損害，因而近年來又研制了非放射性物質(zhì)標記核酸的方
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