重組dna技術(shù)與基因工程(文件)
【正文】 數(shù)種外源蛋白在該系統(tǒng)中獲 個(gè)拷貝，因此重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。 利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗 F 6 外源基因在酵母中的表達(dá) 產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母 乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母 利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗 F 6 外源基因在酵母中的表達(dá) 乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 乙肝病毒是一種蛋白包裹型的 雙鏈 DNA病毒 ， 具有感染力的病毒 乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu) 顆粒呈球面狀 ， 直徑為 42nm， 基因組僅為 。包裝蛋白共有三種轉(zhuǎn)膜糖蛋白： S、 M、 L多肽 。 目前 ， 由釀酒酵母生產(chǎn)的重組 HBsAg顆粒已作為乙肝疫苗商品化 重組產(chǎn)物的最終產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞總蛋白量的 1%2%。 產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母 G 酵母糖蛋白生產(chǎn)的人源化改造 6 外源基因在酵母中的表達(dá) 除抗體外 ， 哺乳動(dòng)物絕大多數(shù)糖蛋白的半衰期和功能依賴于糖鏈末端的 唾液酸 ， 其它裸露的末端糖 （ 如甘露糖 、 N乙酰葡糖胺 、 半乳糖等 ）會(huì)被糖特異性的受體或凝集素清除 。 ER ER 兩種多糖合成途徑的比較 人類糖蛋白側(cè)鏈多聚糖的成熟，涉及下列基因編碼的酶系： MnsI： a1,2甘露糖苷酶 I MnsII： a1,2甘露糖苷酶 II GnTI： b1,2N乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶 I GnTII： b1,2N乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶 II GalT： b1,4半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶 SiaT： a2,6唾液酸苷轉(zhuǎn)移酶 巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中不存在上述酶系。 然而 ， 大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的關(guān)鍵是酵母對(duì)高濃度乙醇和葡萄糖的耐受性 。 RNA聚合酶 II 系統(tǒng)包含 75 種一般轉(zhuǎn)錄因子或共激活因子 ， 其中最關(guān)鍵的是TFIID復(fù)合物 ， 包含 TATABOX結(jié)合蛋白 （ TBP， 由基因 SPT15 編碼 ） 及其及 14 種激活因子 （ TAFs） 。然后在逐次提高的高濃度乙醇和葡萄糖存在下篩選耐受 突變株。 spt15300突變株即使在 15%的乙醇存在下，也顯示出比對(duì)照野生株高出近 1倍的耐受性。 突變 株中表達(dá)最高的 12個(gè)基因，如果被單獨(dú)敲除，則由 spt15300突變?cè)斐傻膬?yōu)勢(shì)全部喪失 spt15300突變株的鑒定 Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2022 spt15300突變株乙醇發(fā)酵的性能參數(shù) 性能參數(shù) 突變株 野生株 改善效果 起始干細(xì)胞重量（ DCW， g / L） 最終干細(xì)胞重量（ DCW， g / L） 體積生產(chǎn)率（ g / L h1） 比生產(chǎn)率（ g / DCW h1） 轉(zhuǎn)化率（ 6 12 h） 乙醇與生物量比值 理論值為 （ g / g） + 20 % + 69 % + 41 % + 14 % + 15 % 98% 86% E 酵母的表達(dá)系統(tǒng) 6 外源基因在酵母中的表達(dá) C 酵母的載體系統(tǒng) B 酵母的宿主系統(tǒng) A 酵母作為表達(dá)外源基因受體的特征 F 利用重組 酵母生產(chǎn)乙肝疫苗 D 酵母的轉(zhuǎn)化系統(tǒng) G 酵母糖蛋白生產(chǎn)的人源化改造 H 酵母轉(zhuǎn)錄機(jī)器的基因工程綜合改造 13901874517 。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 ， 任何單一或兩兩組合位點(diǎn)的突變 ， 都不能產(chǎn)生顯著的功效 ， 巴斯德畢赤酵母 TATABOX結(jié)合蛋白變體 Spt15300 Repeat Element 1 Repeat Element 2 Helix 2 Helix 2’ F177S Y195H K218R 突變的相對(duì)累積效應(yīng) 這充分表明三聯(lián)突變的重要性。 釀酒酵母轉(zhuǎn)錄機(jī)器的定向改造 Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2022 利用易錯(cuò) P C R 技術(shù) 構(gòu)建SPT15的突變文庫(kù) ， 轉(zhuǎn)入釀酒酵母標(biāo)準(zhǔn)單倍體 BY4741株 ， 該單倍體含有內(nèi)源性野生型的 SPT15染色體拷貝 。 這便是 轉(zhuǎn)錄機(jī)器綜合基因操作戰(zhàn)略 的 Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2022 理論基礎(chǔ)。 基因工程改良能否突破這一極限呢 ？ Hal Alper等人提出的所謂 轉(zhuǎn)錄機(jī)器綜合基因操作戰(zhàn)略 （ Global transcription machinery engineering， gTME）讓我們看到了新的希望。 N乙酰甘露糖胺激酶 融 合體 巴斯德畢赤酵母糖鏈合成的人源化改造 JC308 WT RDP750 YSH557 YSH597 Y11430 WT YSH551 Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2022 YSH577 rEPO 改善唾液酸化反應(yīng)的效率： 優(yōu)化 GNE、 SPS、 CSS、 CST基因的密碼子； 構(gòu)建其它形式的 唾液酸轉(zhuǎn)移酶 （ ST） 融合肽 ， 發(fā)現(xiàn)來(lái)自小鼠 a2,6ST的催化功能域與釀酒酵母甘露糖基轉(zhuǎn)移酶 1 將上述五個(gè)基因全部克隆在一個(gè)表達(dá)載體上 ， 并用該表 （ Mnt1）的靶向信號(hào)肽相融合的嵌合體，特別有效； 達(dá)載體轉(zhuǎn)化 YSH577株，獲得 YSH597株。 酵母和絲狀真菌作為重組蛋白表達(dá)系統(tǒng) ， 與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比 ， 具有較高的重組蛋白表達(dá)率 、 較短的發(fā)酵周期 、 能在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)等很多優(yōu)勢(shì) 。 產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母 整合型重組巴斯德畢赤酵母的構(gòu)建 PARS2 Bgl II 5’ AOX1 HBsAg PHIS4 3’ AOX1 Bgl II pBSAG151 11 kb Bgl II 5’ AOX1 HBsAg PHIS4 3’ AOX1 his+的轉(zhuǎn)化子 重組分子 轉(zhuǎn)化 his的受體細(xì)胞 染色體 DNA 重組巴斯德畢赤酵母的性能 由于巴斯德畢赤酵母染色體 DNA上還擁有第二個(gè)乙醇氧化酶基因 AOX2， 所以整合型重組菌仍能在含有甲醇的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。雖然這種質(zhì)膜來(lái)源的 疫苗具有較高的免疫原性，但由于原
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