動物寄生蟲病pcr診斷技術(shù)(文件)
【正文】 Forward primer (100 pmol/ml, JB3) Reverse primer (100 pmol/ml, ) Ex Taq (5 U/ml) 模板 (gDNA) 1____________________________________________________ 總量 25coxI基因的PCR擴增條件：94℃變性 5 min94℃變性 30 s 55℃復(fù)性 30 s 30個循環(huán)72℃延伸 30 s72℃延伸 5 min 擴增完畢后，取出PCR擴增產(chǎn)物于4℃/20℃冰箱保存?zhèn)溆?。待膠凝固后，從膠模上除去封帶，拔出梳子放入電泳槽中，加入足夠量的電泳緩沖液（要求緩沖液液面高出凝膠表面約1 mm）。④ 結(jié)果觀察：將電泳好的瓊脂糖膠置于紫外透射儀中，打開紫外燈，若看到橙紅色的核酸條帶，則說明有擴增的PCR產(chǎn)物；根據(jù)條帶粗細，可粗略估計該條帶的DNA量；根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA對照，通過線性DNA條帶的相對位置可初步估計擴增產(chǎn)物的分子量。 為驗證PCR擴增產(chǎn)物的種或株特異性，往往需對PCR擴增產(chǎn)物進行測序驗證。PCR產(chǎn)物的純化方法一般有兩種：一種是切膠回收，另一種是PCR產(chǎn)物直接回收。如果PCR擴增產(chǎn)物很特異，且引物長度小于60 bp，則兩種方法都可選用，但如果有非特異性條帶或引物長度大于60 bp時，就必須用切膠純化的方法。注意：必須將電泳槽用自來水充分沖洗，電泳緩沖液一定要換新鮮干凈的，以保證不會有其它DNA污染。l的DNA溶液加入400 181。⑤ 取下UNIQ10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ10柱放回收集管中，加入500 181。⑧ ml離心管中，在柱膜中央加30 181。l PCR純化產(chǎn)物加適量加樣緩沖液混合，瓊脂糖電泳檢查回收率，可根據(jù)帶的亮度估算DNA回收純化后的濃度。適當(dāng)降低離心轉(zhuǎn)速有助于提高DNA結(jié)合率。⑤ 倒掉收集管中的廢液，將UNIQ10柱放回收集管中，高速離心（10000 rpm）1 min。⑧ 取5~10 181。1．PCR反應(yīng)。l） _________________________________________________ 模板（gDNA） 1同時設(shè)陽性對照和空白對照。 %TBE瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙錠染色，紫外投射儀下觀察結(jié)果。3．整個操作過程中，一定要注意不要交叉污染。2．用微波爐煮膠時，膠液的量不要超過三角瓶容量的1/3，否則易溢出。5．加樣前需趕走點樣孔中的氣泡，點樣時吸管頭垂直，切勿碰壞凝膠孔壁，以免使帶型不整齊。每次使用后一定要將瓶蓋擰緊，以保持Wash solution中的乙醇含量。4. 切膠回收時的瓊脂糖凝膠電泳，必須將電泳槽用自來水充分沖洗，其電泳緩沖液一定要換新鮮干凈的，以保證不會有其它DNA污染。8。6．使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒時，模板DNA的存在不影響下游工作，而對于質(zhì)粒模板則要特別小心。3. 切膠回收時，對于高濃度的膠（~2%），每100 mg凝膠加入700 181。廢棄膠應(yīng)集中處理，切勿亂丟。4．倒膠注意厚度（4~6 mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齒孔形狀完好。操作完畢后，臺面要用酒精擦拭數(shù)次；鑷子和剪刀經(jīng)清洗后先用酒精消毒，再用紫外燈照射1~2小時以破壞或降解殘余的DNA，以免污染其它實驗。 四、實驗注意事項（一）寄生蟲基因組DNA的提取及純化1．操作中所使用的鑷子和剪刀一定要事先滅菌并于超凈工作臺中紫外照射1~ h，以保證沒有污染其它DNA。 反應(yīng)條件為：96℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性1min、65℃退火2min，共30個循環(huán)，最后72℃后延伸7 min。l） Reverse primer（Tn01R, 50 pmol/181。（六）動物寄生蟲病特異PCR診斷技術(shù)實例以檢測雞柔嫩艾美爾球蟲感染為例，選用Fernandez等（2003）報道的柔嫩艾美爾球蟲種特異的引物(Tn01F：5’CCGCCCAAACCAGGTGTCACG3’。l Elution Buffer或雙蒸水（pH＞）到UNIQ10柱中，室溫或37℃放置2 min（提高洗脫溫度至5580℃有利于提高DNA的洗脫效率）。l Wash solution，高速離心（10000 rpm）30 sec。l，加入3倍體積的Binding buffer，混勻。（提高洗脫溫度至5580℃有利于提高DNA的洗脫效率）⑨ 10000 rpm高速離心1 min，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存于20℃?zhèn)溆?。?重復(fù)步驟“⑤”一次。④ 將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到套放于2 ml
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