【正文】 φ8mm） 0．5 0．6105 0．250．5 (2)②溶液B：用HBS稀釋6μl脂質(zhì)體到終容積50μl（120μg/ml）。 不要移去培養(yǎng)基，逐滴加入100μl 脂質(zhì)體/DNA混合物（從培養(yǎng)孔一邊到另一邊），邊加邊輕搖培養(yǎng)板。(5)G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系總結(jié) 四（一）篩選結(jié)果鑒定：（1）基因組DNA提取→PCR鑒定外源基因（2）SHG44重組pcDNA3陽(yáng)性細(xì)胞、SHG44vect裂解→聚丙烯酰胺凝膠電泳→免疫印跡鑒定P16蛋白表達(dá)（Westernblot）。三、注意事項(xiàng)用于轉(zhuǎn)染的核酸應(yīng)高度純化。即使對(duì)于同一種細(xì)胞其篩選劑量和篩選時(shí)間也不一樣。 ２。必須指出，單克隆化要做幾遍，一遍是不夠的，我前十代都是這樣的，結(jié)果綠色熒光蛋白不但沒(méi)減弱，反而增強(qiáng)了很多。按您的講法，篩選要進(jìn)行10代，那么維持劑量要進(jìn)行多長(zhǎng)時(shí)間？如果我使用對(duì)照組,在對(duì)照組細(xì)胞全部死亡后就用維持劑量進(jìn)行培養(yǎng)行嗎？ 3。neo基因也是這樣，而且，同一細(xì)胞中不同基因的拷貝數(shù)不會(huì)相同，不同細(xì)胞同一基因的數(shù)目也不會(huì)相同，這點(diǎn)可以用數(shù)學(xué)關(guān)于泊松分布的觀點(diǎn)理解。打個(gè)比方，一個(gè)大口袋，抓１００個(gè)紅球，再抓100個(gè)黃球，然后以從中抓若干個(gè)，這些球均為紅球的概率有多大呢？應(yīng)該是很小的。３。 ４。胰酶的作用不必理會(huì)，有的細(xì)胞受影響，還有的細(xì)胞不受影響，由幾代之后，不受影響的細(xì)胞會(huì)占優(yōu)勢(shì)的。僅是我從臨床抗生素和化療藥的使用原則中悟出的道理，實(shí)在是個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，而且在基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域頂多算票友，我還是想聽(tīng)聽(tīng)諸位專業(yè)人士的理解和經(jīng)驗(yàn)。對(duì)普通的表達(dá)載體來(lái)說(shuō)，即使抗性基因表達(dá)也無(wú)法保證外源基因的整合，表達(dá)載體隨機(jī)整合的結(jié)果常常導(dǎo)致目的基因的損壞甚至丟失。G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系PROTOCOL： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10ml，過(guò)濾消毒，4度保存。：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。假如是400ug/ml不能殺死細(xì)胞，而800ug/ml在第5天就把所有細(xì)胞都?xì)⑺懒?，則可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml進(jìn)一步篩選，以確定最佳篩選濃度！心得：由于特性明確的細(xì)胞系G418的最佳用量還是比較穩(wěn)定的，所以有時(shí)候不需要在這么大范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。a 轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時(shí)或者更長(zhǎng)，到細(xì)胞增長(zhǎng)接近匯合時(shí)按1：4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增至50％～70％匯合時(shí)；b 加G418:去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按最佳篩選濃度配制好的G418篩選培養(yǎng)基。在96孔板中加入培養(yǎng)基150ul/孔，再加入細(xì)胞懸液10ul/孔。沒(méi)有經(jīng)過(guò)篩選前大部分轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的質(zhì)粒是存在于胞質(zhì)中的，但是這種質(zhì)粒是不穩(wěn)定的，基本上篩選不出這種單克隆，只有穩(wěn)定整合入染色體的才是我們想要的穩(wěn)定細(xì)胞系。細(xì)胞越多則其同化作用越強(qiáng)，所以細(xì)胞數(shù)目多比數(shù)目少較易生長(zhǎng)。也就是說(shuō)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞可以耐受G418，而未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞不能耐受G418，因而被殺滅或抑制。建議你再多查找一下國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)手之前一定要明白其原理，要不然會(huì)很盲目，充分的準(zhǔn)備可以避免走很多不必要的彎路！問(wèn)：第二次篩選要怎么做？答：第二次篩選就是將轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞接種培養(yǎng)后，向培養(yǎng)液中加入G418以殺傷或抑制其中的未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，因?yàn)椴还苻D(zhuǎn)染效率多么高，都不可能是100%，所以要通過(guò)G418篩選體系（或者其他篩選體系）來(lái)篩掉那些沒(méi)有成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，此時(shí)加入G418的濃度可以略高于你第一次預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)摸索出來(lái)的“最小有效濃度”，實(shí)驗(yàn)中可以再根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行濃度的調(diào)整！問(wèn)：第二次篩選是經(jīng)過(guò)第一次篩選以后，已經(jīng)篩選出一部分轉(zhuǎn)染細(xì)胞了，但是因?yàn)橛行┘?xì)胞還是會(huì)丟失目的基因所以要得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞還要進(jìn)行23次篩選，這時(shí)候還是用原來(lái)預(yù)實(shí)驗(yàn)的濃度，還是要再提高一個(gè)濃度？答：你要在熒光顯微鏡下觀察一下，判斷一下細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率，也就是轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞的比例，再根據(jù)情況選用或高或低的濃度！轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞的比例越高，則加入G418的濃度就可以越低。所以篩選不能太早，但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增殖較慢，時(shí)間長(zhǎng)了就會(huì)被沒(méi)有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒(méi)，最終導(dǎo)致篩選不出陽(yáng)性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24 h之后才開(kāi)始加G418篩選 。約一周左右，中濃度的孔中出現(xiàn)死細(xì)胞，低濃度的死細(xì)胞較少，未加G418的孔長(zhǎng)得很密。外源基因進(jìn)入細(xì)胞后，部分能夠通過(guò)細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，根據(jù)細(xì)胞類型，至多80％的進(jìn)入核內(nèi)的外源DNA得到瞬時(shí)表達(dá)。一般情況下這種新表型由共轉(zhuǎn)染的編碼抗生素抗性基因提供。當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適的地方后 ,則能啟動(dòng)neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA,從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá) ,使細(xì)胞獲得抗性而能在含有Ｇ418的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。但有一點(diǎn)，其實(shí)我覺(jué)得問(wèn)題也不是很大，那就是：在老外的一本實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中提到，在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)所用培養(yǎng)基中最好不加任何抗生素。有人認(rèn)為用磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法篩選穩(wěn)定整合子較好，但這種觀點(diǎn)是很多年以前的觀點(diǎn)了，而且只是少數(shù)人的觀點(diǎn)。非脂質(zhì)體是這幾年發(fā)展很快的技術(shù)，轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞毒性小，價(jià)格也不貴，Qiagen就有一個(gè)系列。有精力就比較一下幾種方法，一般的用達(dá)到目的就行了。磷酸鈣便宜，但對(duì)溶液配置和實(shí)驗(yàn)操作要求很高，尤其是溶液的PH值，要求精確到小數(shù)點(diǎn)后2位。因?yàn)閼c大霉素、鏈霉素、G418均是氨基糖甙類藥物，其藥理作用完全一樣。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞膜受到影響，抗生素可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)染時(shí)不加其它抗生素。G418是一種氨基糖類抗生素，其結(jié)構(gòu)與新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，它通過(guò)影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成,對(duì)原核和真核等細(xì)胞都有毒性 ,包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞 ,也包括原生動(dòng)物和蠕蟲(chóng)。細(xì)胞基因組自由部分表達(dá)，所以整合并不一定意味著表達(dá)，只有整合到表達(dá)區(qū)的基因才會(huì)表達(dá)，而且整合到不同的染色體區(qū)段的外源基因的表達(dá)的量也是不同的。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：24孔板，細(xì)胞密度也較小，轉(zhuǎn)染后第二天1：10稀釋傳代，設(shè)立空白細(xì)胞對(duì)照組，第三天加G418（600μg/ml）。我的是這樣做的：G418篩選實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，生長(zhǎng)較快，所以在96孔板中加入100ul細(xì)胞（2000/ml），第二天就加入G418，從0，100，200…1000μg/ml，復(fù)3孔，每天觀察。以1014天細(xì)胞全部死亡的濃度為篩選濃度。如果G418濃度太高則會(huì)殺傷所有的細(xì)胞，如果G418濃度太低則沒(méi)有什么毒性，兩種情況都不能起到篩選作用。我是用適應(yīng)性培養(yǎng)基來(lái)解決這一問(wèn)題的：適應(yīng)性培養(yǎng)基的配制a 培養(yǎng)同源細(xì)胞至半?yún)R合狀態(tài)時(shí)，更換一次培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)24～48小時(shí)后，吸出所有培養(yǎng)液b 離心：3000～4000rpm 10 min后，吸取上清液c 慮過(guò)：，再加入2倍體積的新鮮培養(yǎng)基，低溫凍存?zhèn)溆?。培養(yǎng)基處理的個(gè)人技巧體內(nèi)的任何細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，對(duì)環(huán)境都有一個(gè)適應(yīng)過(guò)程，期間細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)液具有同化作用，即細(xì)胞從培養(yǎng)液中攝取營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)，也向培養(yǎng)液排出自己的代謝產(chǎn)物和其它一些物質(zhì)，其中有排泄物也有促細(xì)胞生長(zhǎng)因子。e 單克隆鑒定：細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總RNA，做RTPCR檢測(cè)目的基因是否存在。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時(shí)，可以把G418濃度減半維持篩選。這時(shí)你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三個(gè)濃度進(jìn)行篩選。：在篩選10～14天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。：在100ug/ml～1000ug/ml范圍內(nèi)確定幾個(gè)梯度，比如先做個(gè)100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度濃度用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基。關(guān)于概率論的思維，我認(rèn)為紅球和黃球的比喻很形象，但未必準(zhǔn)確。通常用的載體是靠非同源重組隨機(jī)整合的，所以為了獲得高表達(dá)細(xì)胞株，需要對(duì)重組克隆進(jìn)行篩選。這就是酶與底物的比例關(guān)系嘛，這回不用數(shù)論的，用米氏方程理解吧。可以再低些，但不能沒(méi)有。我們用neo，實(shí)際上是篩選的外源基因整合的數(shù)目，怎么說(shuō)呢？用剛才的例子來(lái)說(shuō)，如果我們抓著５個(gè)紅球，另一次抓著１０個(gè)紅球，可以肯定，的二次抓的球比較多，那么第二次黃球數(shù)目比第一次多的概率就很大了。 ２。既然細(xì)胞表達(dá)neo,從理論上講是否無(wú)論多大濃度的G418對(duì)之都無(wú)影響？A：，外源基因與宿主染色體之間的整合是隨機(jī)的而且不是單拷貝的，這點(diǎn)我們做過(guò)FISH驗(yàn)證過(guò)，表達(dá)量與整合數(shù)目，上游序列特性，特定部位DNA立體結(jié)構(gòu)都是相關(guān)的，裝入了SV40只是增加了表達(dá)了數(shù)目，但并不能掩蓋其它因素對(duì)表達(dá)的影響。我的質(zhì)粒中含有SV40與neo基因，好像就不存在外源蛋白表達(dá)少的細(xì)胞形成優(yōu)勢(shì)這個(gè)問(wèn)題了吧。所以，要進(jìn)行單克隆化操作，使得到的均來(lái)自于同一祖先細(xì)胞，遺傳性狀盡量一致，也是對(duì)高表達(dá)細(xì)胞的保護(hù)。 ３。不知這種觀點(diǎn)對(duì)不對(duì)。A：. 如果克隆效率較低的細(xì)胞,如果不是每孔單個(gè)細(xì)胞,一個(gè)96孔板也只能培養(yǎng)一萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,十萬(wàn)個(gè)細(xì)胞就至少需要10個(gè)板,100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞就需要100個(gè)板,對(duì)于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞篩選或基因打靶,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞共同培養(yǎng)活力好. 因此還得看這位朋友使用的是什么細(xì)胞,有限細(xì)胞系還是無(wú)限細(xì)胞系,轉(zhuǎn)基因還是非轉(zhuǎn)基因,篩選還是不篩選,需要的單細(xì)胞克隆株數(shù)量多少? 預(yù)備脂質(zhì)體/DNA混合物必須在無(wú)血清下進(jìn)行。但是，脂質(zhì)體以及脂質(zhì)體/ DNA混合物無(wú)需濾過(guò)除菌。②細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定：SHG4SHG44vect、SHG44重組pcDNA3→5104/孔接種24孔培養(yǎng)板→24hr后各自用苔盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞→計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制百分率。 6hr后