【正文】 ? 細(xì)菌菌體培養(yǎng)時(shí)間一般為 1~2天，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌培養(yǎng)則需要 5~10天。 放線菌孢子的制備 ? 放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機(jī)鹽等。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機(jī)上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體（短菌絲），作為種子。 ? 種子罐級數(shù)取決于： ? 菌種生長特性（如菌種傳代后的穩(wěn)定性）、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度； ? 所采用發(fā)酵罐的容積 ? 另外還與發(fā)酵罐中種子培養(yǎng)液的最低 接種量（種子液體積 /培養(yǎng)液體積） 以及種子罐與發(fā)酵罐的容積比等有關(guān)。但也與所選用工藝條件有關(guān)。 ? 蛋白胨加工原料不同如魚胨或骨胨對孢子影響也不同。 ?菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。 （ 2）濕度 制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對孢子的數(shù)量和質(zhì)量有較大的影響。 培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間 （ 1）培養(yǎng)時(shí)間 ?一般來說， 衰老的孢子不如年輕的孢子 ，因?yàn)樗ダ系逆咦右言谥鸩竭M(jìn)入發(fā)芽階段，核物質(zhì)趨于分化狀態(tài)。如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng) 4天左右即于 4?C冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏 7~8天菌體細(xì)胞開始自溶。 接種量 ?接種量大小影響到培養(yǎng)基中孢子的數(shù)量，進(jìn)而影響菌體的生理狀況。時(shí)間太長，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長緩慢。但接種量過大或者過小，均會影響發(fā)酵。 ? 菌種穩(wěn)定性的檢查 ? 無雜菌檢查 四、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 形態(tài) ?單細(xì)胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)； ?霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對某些染料著色力強(qiáng)、生長旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好。 五、種子異常分析 ?菌種生長速度，過快或過慢 ?菌絲結(jié)團(tuán) ?菌絲粘壁 第四節(jié) 菌種的保藏與復(fù)壯 一、菌種保藏的意義 菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料，特別是利用微生物進(jìn)行有關(guān)生產(chǎn)如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于“體眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。 B 石蠟油封存法（酵母） 向培養(yǎng)成熟的菌種斜面上，倒入一層滅過菌的石蠟油，用量要 高出斜面一厘米 ，然后保存在冰箱中。適合于 產(chǎn)孢子或芽孢 的微生物。 其次 ， 將斜面孢子制成孢子懸浮液接入沙土管中或?qū)⑿泵骀咦庸蜗?直接與沙土混合 ， 于干燥器中用真空泵抽干 ， 放在冰箱內(nèi)保存 。在這樣的環(huán)境中，微生物的生長和代謝都暫時(shí)停止，不易發(fā)生變異。 這種方法的 基本操作 過程是先將微生物 制成懸浮液 ， 再 與保護(hù)劑混合 ，然后放在特制的安瓶管內(nèi)，用低溫酒精或干冰，使其迅速凍結(jié)，在 低溫下用真空泵抽干 ，最后將安瓿管真空熔封，并低溫保藏。 E 液氮超低溫保藏法 （ 細(xì)菌 ， 真菌 ） 液氮超低溫保臧法足近幾年才發(fā)展起來的 ， 此法國外已較普遍采用 ， 是適用范圍最廣的微生物保藏法 。這是因?yàn)橐旱臏囟瓤蛇_(dá) 一 196℃ ，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其 新陳代謝作用停止的溫度（一 130℃ ） ，所以此時(shí)菌種的 代謝活動(dòng)已停止 ， 化學(xué)作用亦隨之消失 。用保護(hù)劑制備好菌液后，加入準(zhǔn)備好的安瓶管中，一般安瓿管的裝量為－ 1mL。 由于液氮要蒸發(fā) ， 這樣溫度就會上升 ， 冰晶狀態(tài)發(fā)生變化 ， 從而導(dǎo)致菌種死亡 。 四、菌種的衰退與復(fù)壯 菌種衰退 菌種經(jīng)過長期人工培養(yǎng)或保藏，由于自發(fā)突變的作用而引起某些優(yōu)良特性變?nèi)趸蛳У默F(xiàn)象。 菌種保藏的原理是什么？常見的軍種保藏方法有哪些？ 菌種退化的原因有哪些？簡述防止菌種退化的措施。 ?復(fù)壯措施： ? 對已衰退菌種配合一定培養(yǎng)條件進(jìn)行單細(xì)胞分離純化 ? 淘汰衰退的個(gè)體 ? 選擇合適的培養(yǎng)基 思考題 名詞解釋 多因素低劑量的誘變效應(yīng)、互變異構(gòu)效應(yīng)、染色體畸變、基因突變、表型延遲、營養(yǎng)缺陷型、雜交育種、原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體再生、菌種的擴(kuò)培、接種量、菌種退化、菌種復(fù)壯 采集土壤微生物樣品時(shí)應(yīng)該注意哪些問題？ 什么是增殖培養(yǎng)？為什么要進(jìn)行增殖培養(yǎng)？ 土壤中分離純化微生物的方法有哪些？請簡述之。 （ 4）重新培養(yǎng) 當(dāng)要使用或檢查所保存的菌種時(shí)，可將安瓿管從冰箱中取出，室溫或 35－ 40℃ 水浴中迅速解凍 ，當(dāng) 升溫至 0℃ 時(shí)即可打開安瓿管 ，將菌種移到適宜的培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)。 這樣在細(xì)胞 接觸低溫前 ， 使細(xì)胞內(nèi)自由水通過膜滲出而不使其遇冷形成冰晶而傷害細(xì)胞 。 （ 2） 菌種準(zhǔn)備及分裝 因?yàn)橐旱ňN要經(jīng)受 超低溫的冷凍過程 。 其保存期最長 。 保護(hù)劑的作用可能是在冷凍干燥的 脫水過程中代替結(jié)合水而穩(wěn)定細(xì)胞成分（細(xì)胞膜）的構(gòu)型 ， 防此細(xì)胞膜因?yàn)閮鼋Y(jié)而破壞 。這種保藏方法雖然需要一定的設(shè)備，要求亦比較嚴(yán)格，但由于該方法保藏效果好，對各種微生物都適用。 D真空冷凍干燥保藏法 （ 細(xì)菌 ， 防線菌 ） 真空冷凍干燥保藏法 是目前常用的較理想的一種方法。 C間歇滅菌三次 ， 滅菌試驗(yàn)合格后烘干備用 。 保存期約一年左右。 菌種保藏的方法很多 ， 一般有下面幾種 ： A 斜面冰箱保藏法 （ 酵母 ） 斜面保藏是一種短期 、 過渡的保藏方法 ， 用新鮮斜面接種后 ， 置最適條件下培養(yǎng)到菌體或孢子生長豐滿后 ， 放在 4℃ 冰箱保存 。其任務(wù)首先是使菌種不致死亡，同時(shí)還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。 產(chǎn)物生成量 ?在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因?yàn)榉N子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。 ? 通常接種量，細(xì)菌 1~5%，酵母菌 5~10%，霉菌 7~15%，有時(shí) 20~25% 三、種子質(zhì)量的控制措施 ?種子質(zhì)量的最終指標(biāo)是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。Ru 嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶， 12小時(shí)最好。 培養(yǎng)條件 （ 1）溫度 （ 2）通氣量 （ 3） pH 種齡 ? 種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。 ? 冷藏時(shí)間對孢子的生產(chǎn)能力也有影響。 ?措施：孢子培養(yǎng)的時(shí)間應(yīng)該控制在 孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常 的階段終止培養(yǎng)。在氣溫高含濕度大的地區(qū)，斜面孢子長得慢， 主要由于試管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。如土霉素生產(chǎn)菌種在高于 37?C培養(yǎng)時(shí)，孢子接入發(fā)酵罐后出現(xiàn)糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價(jià)降低等現(xiàn)象。磷含量太多或太少也會影響孢子的質(zhì)量。 種子質(zhì)量的控制 一、影響孢子質(zhì)量的因素及控制 ?培養(yǎng)基 ?培養(yǎng)條件 ?培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間 培養(yǎng)基 ? 生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動(dòng)。 茄子瓶 → 種子罐 → 發(fā)酵罐 ? 霉菌：生長較慢 ， 如青霉菌 ， 三級發(fā)酵 孢子懸浮液 → 一級種子罐 （ 27?C,40小時(shí)孢子發(fā)芽 ， 產(chǎn)生菌絲 ） → 二級種子罐（ 2