【正文】 感試驗是將不同劑量的抗菌藥物，分別加入融化并冷至45℃的定量瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，制成無菌平板，即為所含藥物濃度遞減的培養(yǎng)基。 2．取已校正濃度的待檢菌液(108CFU／ml)接種于含藥瓊脂的表面，操作時從最低濃度的瓊脂種起，使每滴約2μl菌液，每一接種點的液滴直徑為5～8mm，注意勿使移動，待接種點干燥后，再將平板翻轉(zhuǎn)，置35℃孵箱內(nèi)孵育16～24h觀察結(jié)果。判定時應(yīng)注意：①薄霧狀生長不算；②＜5個菌落不算；③若在數(shù)個平板上呈拖尾或跳管生長等現(xiàn)象，應(yīng)該重做。盡管E試驗的操作與紙片擴(kuò)散法相似，但它又不同于常規(guī)紙片法，表現(xiàn)在預(yù)先形成的穩(wěn)定的抗生素濃度梯度的使用。 根據(jù)不同的抗生素，～32μg／～256μg／～1024μg／ml的連續(xù)濃度范圍。橢圓環(huán)邊緣與試條的交界處刻度(以μg／ml為單位)即為MIC值。所需培養(yǎng)基與添加物隨受試菌不同各異。對非常敏感菌株，每平板的試條數(shù)應(yīng)減少些。使用模板墊在平板下來準(zhǔn)確定位試條所在平板的位置。一旦放好，切勿再移動試條，因為抗生素在瞬間已擴(kuò)散進(jìn)入瓊脂。當(dāng)抑菌橢圓環(huán)伸至試條下方時，即環(huán)的邊緣與試條無交點時，MIC應(yīng)報告為小于讀數(shù)刻度的最低值。 【方法】 1．標(biāo)本采集 ①一般用無菌棉棒(拭子)采取膿汁及病灶分泌物。 ⑤對可疑為敗血癥的病人，按無菌操作采血5ml，立即注入葡萄糖肉湯培養(yǎng)基內(nèi)增菌，12～18h后再作分離培養(yǎng)。將菌落的剩余部分移種于普通瓊脂(或血液瓊脂)斜面上，以便獲得大量純種細(xì)菌做進(jìn)一步的檢查。 若呈草綠色溶血時，為甲型溶血性鏈球菌，但應(yīng)做膽汁(膽鹽)溶解試驗和菊糖發(fā)酵試驗與肺炎球菌相鑒別。此法較簡便，但不如試管法銳敏、準(zhǔn)確。6．膽汁(膽鹽)溶解試驗 肺炎球菌能被膽汁或膽鹽溶解，甲型溶血性鏈球菌則不能，故可用做二者的鑒別。肺炎球菌可被膽鹽溶解液體變?yōu)橥该?，而甲型溶血性鏈球菌不被溶解，液體仍呈混濁狀態(tài)．實驗2 細(xì)菌血漿凝固酶試驗 致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可凝固新鮮的人血漿或兔血漿。 （二）試管法 吸取1：4稀釋的兔血漿放于二支滅菌小試管中，用滅菌接種環(huán)沾取葡萄球菌培養(yǎng)物一滿環(huán)，在一小試管內(nèi)壁徐徐研磨使成均勻懸液?！窘Y(jié)果判定】 于半分鐘內(nèi)有大量氣泡產(chǎn)生者為陽性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性。實驗4 細(xì)菌耐熱核酸酶試驗 【原理】 金黃色葡葡萄球菌能產(chǎn)生一種耐熱核酸酶，它需Ca2+作為激活劑，對熱有顯著的抵抗力(100℃15分鐘)，而任何其它來源的DNA酶均不具有這種耐熱的性質(zhì)。 【方法】 將被檢菌12—18h培養(yǎng)物置沸水中煮沸15min，冷卻后，吸取此培養(yǎng)物1~2滴，％DNA瓊脂平板表面，37℃孵育18~24h，然后用1MHC1傾注平板，觀察結(jié)果?！静牧稀竣傩“资螈诟腥痉窝浊蚓男“资笈K器研磨懸液③肺炎球菌血平板培養(yǎng)物制作的懸液④革蘭氏染色液⑤動物解剖用具(一套)，注射器、滅菌棉花紙包、碘酒棉球、酒精罐。 圖4—1小白鼠的抓取 圖4—2小白鼠的固定和腹腔內(nèi)注射 4． 以無菌鑷子取碘酒棉球，消毒小白鼠左下腹部，用鑷子取下注射器針頭上的棉花紙包，放入消毒罐中。逐日觀察，記錄觀察結(jié)果。用碘酒棉球消毒胸腹部皮膚。圖4—3 小白鼠的固定菽皮映切開法 用鑷子把持劍突，由劍突下部開始用剪刀剪斷兩側(cè)肋骨與肋軟骨結(jié)合部位，向上翻轉(zhuǎn)揭開胸壁。觀察腹腔有無積液，觀察腹部各臟器的狀態(tài)，特別是肝、脾的狀態(tài)，剪取臟器組織塊進(jìn)行涂片。 1． 實驗動物的管理 ④實驗室常用的動物有家兔、豚鼠(荷蘭豬)、小白鼠、大白鼠、地鼠、綿羊、雞等，根據(jù)實驗的目的，選擇最適宜的動物。 ③實驗動物要精心飼養(yǎng)、喂以適當(dāng)?shù)娘暳?，并給以充足的飲水。 ⑥接種后的動物應(yīng)每天觀察l一2次，注意動物的精神狀態(tài)、活動能力，飲食和大小便情況、體溫、注射部位的反應(yīng)以及全身反應(yīng)，如不安、聳毛、震顫、弓背、麻痹及死亡等，并應(yīng)詳細(xì)記錄之。接種用器材(。動物的排泄物及使用的籠罐等必須嚴(yán)格消毒，任何用過的動物，不宜再做其它試驗。 ⑨實驗動物應(yīng)做好標(biāo)記，對較大動物如家兔、豚鼠等可用金屬號碼牌固定于耳朵上，對較小動物如大白鼠、小白鼠等可用復(fù)紅(紅色)和苦味酸(黃色)等染料涂于身體的不同部位，以資識別。購買的動物，一般至少要隔離觀察10天，證明無隱性傳染病方可使用。將上述涂片行革蘭氏染色,鏡檢,與接種的懸液涂片進(jìn)行對比,并分析結(jié)果。無菌操作剪開心臟并用接種環(huán)沾取心血進(jìn)行涂片，同時剪取肺組織塊進(jìn)行涂片。如圖4—3所示，首先沿正中線由恥骨剪至下腭部，再向四肢剪開皮膚。解剖前一切解剖用具(如剪子、鑷子等)應(yīng)煮沸10分鐘消毒，并備一酒精瓶以便將解剖用具隨時沽取酒精，點燃消毒。 將小白鼠用染料涂抹做好標(biāo)記，放入動物罐中。 2． 用消毒好的注射器，按無菌操作法抽取菌懸液后，再用無菌鑷子夾一滅菌棉花紙包，將針頭刺入棉花紙包內(nèi)，排出注射器內(nèi)的氣體，然后將注射器平置于試管架上。此試驗可用于區(qū)分金黃色葡萄球菌和表皮及腐生葡萄球菌。故于DNA瓊脂板上加入鹽酸，可在產(chǎn)生耐熱DNA酶的部位形成透明圈。此試驗不宜用血平板上的菌落，因紅細(xì)胞內(nèi)含有此酶，會出現(xiàn)假陽性。實驗3 細(xì)菌的觸酶試驗【材料】 3％過氧化氫水溶液(新鮮配制)，載玻片。 (一)玻片法 在載物片兩端各滴鹽水一滴，取葡萄球菌平板培養(yǎng)物放生理鹽水中混成均勻菌液，在其中一端的菌液中加兔血漿一滴搖勻，立即觀察結(jié)果，如血漿中有明顯小凝塊出現(xiàn)，而生理鹽水中無此現(xiàn)象者為陽性，若血漿中無凝塊時為陰性。然后，其中一支加10％()。另一試管做為對照，將二試管放在37℃水浴箱中，每半小時觀察一次結(jié)果，觀察至4h。檢測此種酶的試驗，常用于鑒定葡萄球菌的致病力，以區(qū)別非致病性葡萄球菌。然后再經(jīng)純種移植，做血漿凝固酶試驗和甘露醇發(fā)酵試驗，確定其致病力。 3．染色鏡檢 將膿汁直接涂片用革蘭氏染色觀察細(xì)菌形態(tài)、排列及染色性，在涂片上通?？梢姷礁锾m氏陽性暗紫色的球菌散在于薔薇色的白細(xì)胞之間或其中。 ③采取膿腫處的膿汁，如懷疑有厭氧菌，最好用注射器抽取膿汁立即送檢。本實驗通過膿汁病原菌檢查這一系統(tǒng)實驗過程，初步掌握化膿性球菌的檢查程序和鑒定方法。【結(jié)果】 達(dá)到要求的孵育時間且細(xì)菌的生長清晰可辨時(圖3—8)，即可在橢圓抑菌環(huán)與E試條的交界處讀取MIC值。必要時，可用鑷子輕壓試條以驅(qū)趕其下方的氣泡，并且總是從濃度最小端向上驅(qū)氣泡。停放10～15min讓瓊脂表面菌液吸收，以保證加試條前瓊脂表面完全干燥。4．制作用于E實驗的加樣模板：用如圖3—7A所示的模板墊襯；可將4～6個不同藥物E試條放到150mm平板上。；厭氧菌在制備過程當(dāng)中極易死亡，要用1號麥?zhǔn)蠞岫取? 當(dāng)E試條被放置在一個已接種細(xì)菌的瓊脂平板上時，其載體上的抗生素迅速且有效地釋放入瓊脂介質(zhì)，從而在試條下方馬上建立了一個抗生素濃度的連續(xù)的指數(shù)梯度。試條的一面標(biāo)有以μg／ml為單位的MIC判讀刻度。E試驗?zāi)苡眠B續(xù)的MIC數(shù)值直接對抗生素的藥敏定量。結(jié)果可用藥物的濃度報告。 【材料】 1．菌種：金黃色葡萄球菌菌液(108CFU／ml) 2．培養(yǎng)基：水解酪蛋白（MHA）培養(yǎng)基(MH肉湯1000ml，調(diào)pH值后，加17g瓊脂，分裝后15磅/英寸2高壓滅菌l5min備用) 3．抗菌藥物原液（1280μg/ml） 4．麥?zhǔn)媳葷峁?，校正待檢菌濃度用。3．將各管中加入已校正濃度的金黃色葡萄球菌菌液(105cfu／ml)，混勻后放置35℃培養(yǎng)18h，觀察結(jié)果。 2．培養(yǎng)基：MH肉湯，去脂肪筋膜牛肉300g絞碎，加蒸餾水1000ml，制成肉浸液。一般抑菌環(huán)直徑在15mm以上者為高度敏感，10～15mm為中度敏感，10mm以下為低度敏感，無抑菌環(huán)者為耐藥。 3．做好標(biāo)記，放37℃溫箱培養(yǎng)過夜(不超過17h)。測量抑菌環(huán)的大小，即可判定該細(xì)菌對某種藥物的敏感程度。 結(jié)果：紫外燈管直接照射處無菌生長，如用玻璃和黑紙遮蓋，則有菌生長。常用的是水銀燈，燈管由石英玻璃制成，管內(nèi)充滿壓強(qiáng)為266Pa的氬和幾滴水銀。濾器經(jīng)高壓滅菌后，洗凈備用。 2．用法：將清潔的濾菌器(賽氏濾菌器和薄膜濾菌器須先將石棉板或濾菌薄膜放好，擰牢螺旋)和濾瓶分別用紙或布包裝好，用高壓蒸汽滅菌器滅菌?！?50μm不等，分為GGGGGG6六種規(guī)格，后兩種規(guī)格均能阻擋細(xì)菌通過。上部的金屬圓筒，用以盛裝將要濾過的液體；下部的金屬托盤及漏斗，用以接受濾出的液體；上下兩部分中間放石棉濾板，濾板按孔徑大小可分為三種：K濾孔最大，供澄清液體之用；EK濾孔較小，供濾過除菌；EK—S濾孔更小，可阻止一部分較大的病毒通過。種類很多，孔徑非常小，能阻擋細(xì)菌通過。 2．用法：將培養(yǎng)皿、吸管、試管等玻璃器材包裝后放入箱內(nèi)，閉門加熱。箱底下放置大型火爐，或在箱壁中裝置電熱線圈。高壓蒸汽滅菌法為濕熱滅菌法，其優(yōu)點有三：一濕熱滅菌時菌體蛋白容易變性，二濕熱穿透力強(qiáng)，三蒸氣變成水時可放出大量熱增強(qiáng)殺菌效果，因此，它是效果最好的滅菌方法。待冷空氣全部排出后（即水蒸氣從排氣閥中連續(xù)排出時），關(guān)閉排氣閥。滅菌器內(nèi)裝有帶孔的金屬擱板，用以放置要滅菌物體(圖3—1)。這里主要介紹物理因素殺滅微生物的幾種方法，以及相關(guān)器材的使用。 — 不形成凝膠。 2．向①、②、③安瓶中分別加待測物、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素、。 2．待測物(血液、細(xì)菌培養(yǎng)上清液或注射劑等)。鱟試驗可測出微量內(nèi)毒素(～／ml)?，F(xiàn)在多種微量、快速、半自動或全自動的細(xì)菌生化反應(yīng)試劑盒和檢測儀器已廣泛應(yīng)用于臨床。有些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸，生成硫化氫，穿刺部位呈黑褐色，是為反應(yīng)陽性。 ④ 枸櫞酸鹽利用試驗(Utilization of citrate) 將細(xì)菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h。 注：甲基紅試劑：，溶于60％的酒精100ml中。 (注)Kofacs試劑：取對二甲基氨基苯甲醛(Paradimethylamino benzaldehyde)4g，加95％酒精380ml，濃鹽酸80ml即成。必要時可培養(yǎng)更長時間后再判定結(jié)果。用于檢測硫化氫的產(chǎn)生。用于V—P試驗和甲基紅試驗。 2．糖發(fā)酵管 成分：蛋白胨水，葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖或麥芽糖等糖，溴甲酚紫(B．C．P)、溴麝香草酚蘭(B．T．B)或酚紅(P．R)等指示劑。然而，這些不同種型的細(xì)菌，其物質(zhì)代謝能力和產(chǎn)物常有所不同，借此可以鑒別細(xì)菌，即為細(xì)菌的生化反應(yīng)檢查，生化反應(yīng)檢查必須使用純種細(xì)菌。接種后放37℃溫箱培養(yǎng)18~24h，肉眼觀察，如培養(yǎng)基出現(xiàn)混濁或形成菌膜、沉淀等，則表示有細(xì)菌增殖，觀察其增殖狀態(tài)，有助于鑒別細(xì)菌。劃線完畢，再將試管口通過一下火焰，棉塞滅菌后，塞好棉塞，最后將接種環(huán)上的殘留細(xì)菌用火焰滅菌。2．斜面培養(yǎng)基接種的純培養(yǎng)法 斜面培養(yǎng)基不易污染，常用于培養(yǎng)純種細(xì)菌。挑菌時不要取菌太多，不要觸碰其它菌落，涂膜切勿太厚，否則影響鏡檢效果。 ②細(xì)菌形態(tài)：選擇經(jīng)肉眼詳細(xì)觀察過的不同種類的孤立菌落各一個，用特殊鉛筆在平皿底部作圈記并編號，然后再涂膜，做革蘭氏染色。 透明度：透明、半透明、不透明等。 表面：光滑、皺紋、濕潤、干燥等。 【結(jié)果觀察】 ①菌落形態(tài)：首先一般先觀察整個平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及種類，然后再選有代表性的各種孤立菌落做如下的詳細(xì)觀察。可根據(jù)菌量的不同，決定分段的數(shù)目。 ②分段劃線法：檢查材料中含菌量較多時，可用此法以求獲得孤立菌落。先將接種環(huán)用火焰滅菌，待冷卻后挑取檢查材料，涂于平板的上端，隨即向下連續(xù)平行劃線至平板的中部，然后將平板旋轉(zhuǎn)180176。本次實驗的目的是學(xué)習(xí)細(xì)菌分離培養(yǎng)與純培養(yǎng)法，掌握幾種常用的細(xì)菌接種技術(shù)。 2．待冷至50℃左右時，加入無菌的脫纖維血液，混勻(注意勿使產(chǎn)生泡沫)。細(xì)菌不能分解瓊脂，故無營養(yǎng)作用，僅是固體培養(yǎng)基的賦形劑。 2．趁熱用pH試紙測酸堿度，用10％。 如用市售的牛肉膏代替新鮮肉水時，～％的水溶液，再如上法制成培養(yǎng)基。 2．1000ml肉水中加入蛋白胨10g、氯化鈉5g，加熱溶解，放涼。(一)肉湯培養(yǎng)基 肉湯培養(yǎng)基是常用的液體培養(yǎng)基，也是制備常用的細(xì)菌分離培養(yǎng)基及其他某些培養(yǎng)基的基礎(chǔ)。要求同學(xué)們了解培養(yǎng)基的制作原則和方法，掌握細(xì)菌的分離培養(yǎng)技術(shù)。再用美藍(lán)染液染色半分鐘，水洗，吸干，鏡檢。同時可能看到?jīng)]有芽胞的繁殖體和失掉菌體的芽胞。 2．滴加3％孔雀綠水溶液加熱染色3～6min，水洗。 乙液 堿性復(fù)紅酒精飽和液 1份實驗5 芽胞染色法 芽胞(Spore)是細(xì)菌的休眠狀態(tài)，對各種理化因素有強(qiáng)大的抵抗力，能耐受惡劣環(huán)境的影響。B．typhi是周身帶有鞭毛的桿菌。 【材料】 ① 傷寒桿菌(Bacillus typhi)斜面純培養(yǎng)物(注：系首先將細(xì)菌在肉湯中多次傳代，然后移種于加少量蒸餾水的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)7~16h)。在小白鼠組織細(xì)胞周圍，有散在成對的小尖矛形的紫色細(xì)菌，細(xì)菌周圍有一淡紫色的亮圈，即為莢膜。 2．染色 ① 取一濾紙片覆蓋于涂膜上，滴加結(jié)晶紫溶液，并在火焰上略加熱至出現(xiàn)蒸氣為止(約1min)。2．常見的與醫(yī)學(xué)有關(guān)細(xì)菌的革蘭氏染色性 葡萄球菌、鏈球菌、四聯(lián)球菌、 球菌 八疊球菌、肺炎鏈球菌等 枯草桿菌