dnarna合成常見問題解答(文件)
【正文】 用來進(jìn)行寡核苷酸的純化。 如果合成的寡核苷酸應(yīng)用于克隆，定向突變或定量的基因檢測，那么對其純度要求較高。反向樹脂化的HPLC與陰離子交換樹脂的HPLC呈現(xiàn)相似的純化效率。盡管PAGE顯示出高的純化效率(＞98%)，但它在額外的步驟方面有一些缺陷，比如在PAGE之后需要提取和脫鹽，繼而將導(dǎo)致純化產(chǎn)率的下降?！25. 修飾寡核苷酸 ↑TOP539。氨基修飾的寡核苷酸可被用于固定所需的寡核苷酸，固定在基質(zhì)上形成寡核苷酸為基礎(chǔ)的微陣列。 539。 539。生物素和內(nèi)部生物素修飾法：熒 光 素 和 內(nèi) 部 熒 光 素 修 飾 法：然而，熒光素有幾個缺陷，包括相對較高光漂白率，pH敏感性(pKa～)，pH低于7時，熒光顯著下降。 TAMRA修飾法：TAMRA結(jié)合物的熒光量子產(chǎn)量通常只有熒光素結(jié)合物的四分之一。TAMRA結(jié)合物不能很好的被568 nm用于很多共聚焦激光掃描(電子)顯微鏡ArKr混合氣體激光激發(fā)。 Cy3 和Cy5的最大吸收/激發(fā)波長是550/570 nm和649/670 nm。包含肌苷的寡核苷酸借助PCR或探針雜交可用于檢測或分析不同的或相似的DNA序列。雙重修飾法(539。熒光素鈉339。許多探針利用寡核苷酸形成反向環(huán)構(gòu)型的特征進(jìn)行設(shè)計。 539。耐熱性DNA聚合酶能夠從鏈狀DNA的539。末端被釋放。端互補，以至于他們不能在339。末端用熒光基團(tuán)標(biāo)記。在完整的探針中，染料的熒光性被消除，在PCR反應(yīng)中探針與靶序列雜交 ，借助耐熱性DNA聚合酶的539。末端有不同的報告熒光，并且一個相同的粹滅劑染料連接在從539。 嚴(yán)格的說，熒光淬滅在使用DABCYL分子指示標(biāo)中不是FRET相關(guān)的，因為它不能滿足重疊光譜的標(biāo)準(zhǔn)?；蛘哌€可用封閉試管和實時程序來檢測。特別是在蛋白質(zhì)水平上分子間的反應(yīng)能夠被完美的設(shè)計，通過生物合理的途徑來提高結(jié)合性，分子間的相互作用成功的被應(yīng)用和被最佳化。 這種被稱為反義策略的方法的優(yōu)勢在于，通過眾所周知的WatsonCrick堿基配對法則，即單鏈核酸與互補的寡核苷酸鏈相互作用形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。首先，脫氧寡核苷酸(ODNs)必須能夠穿越細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。然而，最近文章的數(shù)據(jù)分析顯示這些理論上的障礙確實存在。雙倍體核酸中，由于堿基堆積產(chǎn)生的PP相互作用, 在260 nm紫外吸收被淬滅。寡核苷酸的順序和長度，適用下述的法則：Tm增加3到5癈粗略的等于締合常數(shù)增加十倍。然而，硫磷酰被看作寡核苷酸第一代類似物，并顯示出抵抗不同靶分子的生物學(xué)活性。后一種方法避免了硫元素在多數(shù)有機(jī)溶劑中不溶解以及二氧化碳毒性的問題。最初，曾有關(guān)于這個同分異構(gòu)體的混合可能會產(chǎn)生不可預(yù)知的結(jié)果的擔(dān)心。units/100 靗)的寡核苷酸混合兩種相同的濃度單鏈寡核苷酸。為了避免形成復(fù)雜的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，寡核苷酸需要更加緩慢的冷卻。 把單鏈寡核苷酸制備成雙鏈DNA寡核苷酸，退火是最簡單的方法，但要求要非常小心的移去不想要的單鏈材料。 Q27. 怎樣制備雙鏈DNA? 生產(chǎn)高純度的硫磷酰。這個衍生性顯示對核酸酶具有不斷增長的抵抗力。核酸酶使寡核苷酸鏈快速降解的主要原因是磷酸二脂骨架結(jié)構(gòu)的水解，部分結(jié)構(gòu)替代已成為增強穩(wěn)定性的主要策略。因此，假定一個二狀態(tài)模型，會得到一個S形曲線，并能計算其熱力學(xué)參數(shù)。 最近的研究焦點在于用化學(xué)方法改善ODNs的特性，主要集中在核苷酸酶抵抗力和mRNA親和力的提高方面。最后，為了抑制致病基因的表達(dá)，ODNs必須能夠特異性結(jié)合并對靶mRNA有高度的親和力。因此，反義策略不被限制于特定類型的疾病而能夠被廣泛地應(yīng)用。 隨著我們對分子生物學(xué)的理解不斷加深，我們慢慢獲得對分子水平疾病的認(rèn)識。與TaqMan探針相比，分子信標(biāo)優(yōu)勢在于能夠進(jìn)行多重PCR檢測，因為，在理論上，他們能同時測定更多的產(chǎn)品。分子信標(biāo)被作為雜交探針后不久被應(yīng)用于PCR，利用它們能夠同互補DNA雜交的原理，它們能夠被用來監(jiān)測一個正在進(jìn)行中的反應(yīng)和在實時PCR中區(qū)別等位基因。靶DNA的鑒定由熒光發(fā)射光譜決定。兩個探針被使用，一個用于正常序列，另一個用于3 bp缺失的互補序列。末端，粹滅劑被放置在探針的339。他們在339。在539。裂解主要發(fā)生在置換的單鏈部分和DNA配對的雙鏈部分的連接處。這種測定法利用耐熱性DNA聚合酶的539。PCR檢測的539。 雙重標(biāo)記的寡核苷酸可在實時PCR中用來檢測DNA的擴(kuò)增。 Dabsyl amp。 經(jīng)硫磷?；墓押塑账釋怂醿?nèi)切酶和核酸外切酶的降解有很好的抵抗作用，這種特性能增加反義寡核苷酸鏈在細(xì)胞內(nèi)的效果。肌苷修飾法： Cy3 及539。TAMRA結(jié)合物比相應(yīng)的熒光素結(jié)合物更明亮。Rhodamines光譜在pH 410之間不受影響，在許多生物學(xué)應(yīng)用方面，這是優(yōu)于熒光素的一個重要的優(yōu)勢。539。在各種各樣的熒光染料中,熒光素(激發(fā)/放射最大波長為494/520 nm)是一種使用最廣泛的熒光基團(tuán) ，用于標(biāo)記和探測生物分子。539。寡核苷酸的巰基能連接多種熒光基團(tuán)并用于DNA測序和雜交。539。磷酸化和339。氨基修飾法： 我們推薦PAGE純化法用于60 mer寡核苷酸的純化。PAGE作為一種純化樹脂，陰離子交換樹脂或反向樹脂被用于寡核苷酸的純化。DMT寡核苷酸間存在強親和力，但是提前終止的寡核苷酸不包含DMT基團(tuán)這一原理，我們能夠成功的把想要的N甲基寡核苷酸從提前終止的寡核苷酸雜質(zhì)中分離出來。DMT基團(tuán)，而提前終止的寡核苷酸不包含該基團(tuán)。盡管脫鹽純化可以移除所有的非必需有機(jī)雜質(zhì)，但它不能有效移除合成中產(chǎn)生的微量的(每個聯(lián)
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