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現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究方法學(xué)生(文件)

 

【正文】 2,磷酸化改變了轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的空間構(gòu)象 。 2,激酶催化的磷酸化可以被磷酸酶所逆轉(zhuǎn)。 磷酸化研究方法 ? 特異性磷酸化抗體直接證明 ? CIAP或 OA間接證明 ? 片段缺失突變和點(diǎn)突變直接證明 ? 同位素標(biāo)記 ? 質(zhì)譜分析 CIAP或 OA處理細(xì)胞證明蛋白磷酸化 CIAP:牛小腸堿性磷酸酶,能夠?qū)?DNA以及蛋白上的磷酸根基團(tuán)去除(孵育蛋白); OA:岡田酸,磷酸酶抑制劑(細(xì)胞處理) 片段缺失突變確定磷酸化的初步位點(diǎn) 點(diǎn)突變確定磷酸化的精確位點(diǎn) (For Erk/MAPK) AKT: RXRXXS TR3: RDHLAS Motif 原理:將未被磷酸化的蛋白與被磷酸化后的蛋白用蛋白酶水解后,進(jìn)行 MS/MS分析,到數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。 ? 如果突變導(dǎo)致錯(cuò)誤的激活去乙?;富蝈e(cuò)誤的和去乙?;赶嗷プ饔?,將可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。 ? 蛋白乙?;淖饔檬蔷S持染色質(zhì)的開(kāi)放結(jié)構(gòu),因而有利于轉(zhuǎn)錄因子與靶 DNA結(jié)合,進(jìn)而促使基因的轉(zhuǎn)錄。 蛋白入核轉(zhuǎn)運(yùn) ? 分子量小于 4550KD的蛋白:在不需要外界能量供應(yīng)的前提下可以通過(guò)核孔自由進(jìn)出(被動(dòng)擴(kuò)散); ? 分子量大于 50KD的蛋白:①依賴于能量和溫度;②需要胞漿運(yùn)輸因子;③需要核孔復(fù)合體蛋白(主動(dòng)運(yùn)輸); 核定位序列 ( nuclear localization sequence, NLS) ? ① 單一型 NLS,由一段連續(xù)的堿性氨基酸順序排列而成 ( RKKKRKV) ? ②雙分型 NLS,由兩簇堿性氨基酸被中間 10- 12個(gè)非保守性氨基酸所分隔而形成 ( KRPAATKKAGQAKKKKLDK) protein importin? protein importin? importin? protein importin? importin? cytoplasm NPC importin? protein importin? Nucleus nucleoprotin IBB IBB GTPase Ran/TC4 蛋白出核轉(zhuǎn)運(yùn) 核輸出序列( nuclear exporting sequence, NES) F X表示任意氨基酸 I I X2- 3表示 2- 3個(gè)任意氨基酸 L X25 L X23 – L L L 亮氨酸 V V 頡氨酸 M甲硫氨酸 M F 苯丙氨酸 I 異亮氨酸 其特征是富含亮氨酸( Leu),但與 NLS無(wú)任何同源性 。 效應(yīng)蛋白: Ran GTPase激活蛋白: RanGAP (細(xì)胞質(zhì) ) RanGAP結(jié)合蛋白: RanBP1 和 RanBP2 (細(xì)胞質(zhì) 細(xì)胞核 ) 鳥嘌呤核苷交換因子: RanGEF( 也稱 RCC1) 細(xì)胞核中 RanGTP再生 核轉(zhuǎn)運(yùn)因子 2(NTF2)與 RanGDP復(fù)合體到達(dá)細(xì)胞核時(shí)遇到 RanGEF( 鳥嘌呤核苷交換因子 ) , 它便將 Ran上的 GDP替換成 GTP。此時(shí) importin?則自由地結(jié)合到其輸出受體 CAS上, CAS和 RanGTP再相互作用形成三聚體復(fù)合物,被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿,由此重新 importin ? cycle。 NTF2與 RanGTP無(wú)親合力,所以可以釋放在細(xì)胞核中。例如: NFKB與其抑制蛋白 IKB NLS的 C端也可能發(fā)生自身折疊而發(fā)生遮蔽效應(yīng)。 ◆ 蛋白激酶磷酸化位點(diǎn) :如 SRF蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子 , 其入核需要 PKA活性 , 但不是直接被 PKA磷酸化 , 說(shuō)明蛋白激酶除了對(duì)轉(zhuǎn)錄因子直接磷酸化外 , 還可能對(duì)蛋白入核轉(zhuǎn)運(yùn)下游的其它蛋白磷酸化 , 從而間接影響轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)運(yùn) 。 ◆ 胞漿錨定機(jī)制 :在爪蟾卵細(xì)胞 xnf7蛋白中 , 有一胞漿滯留區(qū) ( CRD) ,具有很強(qiáng)的錨定功能;只有當(dāng) CRD序列上的 P34cdc2位點(diǎn)脫磷酸化后引起 CRD失活 , 其錨定功能喪失 , xnf7蛋白才能夠轉(zhuǎn)運(yùn)入核 。 而 P34cdc2對(duì) NLS磷酸化則抑制蛋白的入核轉(zhuǎn)運(yùn)。 在胞漿中, RanGTP在 RanGAP/RanBP1的協(xié)助下轉(zhuǎn)換為 RanGDP,然后重新通過(guò) NTF2的介導(dǎo) 進(jìn)行新一輪的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。 蛋白核漿轉(zhuǎn)運(yùn)模型: 含有典型的 NLS序列的蛋白被 importin?識(shí)別,再與 importin?結(jié) 合形成三聚體,并通過(guò) importin?靶向核孔完成蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。 為出核過(guò)程提供能量的仍然是 NPC上的 GTPase Ran/TC4。 ? 而帶正電荷的賴氨酸殘基與 DNA之間的相互作用可限制核小體在 DNA之間的移動(dòng),使啟動(dòng)子接近轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,組蛋白低乙酰化使染色質(zhì)失去轉(zhuǎn)錄活性。 MeCP2突變導(dǎo)致 Rett綜合征,患者出生即發(fā)病、智力發(fā)育遲緩、伴孤獨(dú)癥。 質(zhì)譜分析蛋白磷酸化 乙?;惓Ec疾病 ? CBP/p300的突變導(dǎo)致 Rubinstein Taybi綜合征,患者智力低下、面部畸形、姆指和拇趾粗大、身材矮小。 4,同一種激酶或磷酸酶都是多底物的,對(duì)不同轉(zhuǎn)錄因子的影響不同。 4,增加蛋白質(zhì)分子表面的負(fù)電荷。 3)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)與其他因子的作用。 但是當(dāng) IκB被 SUMO修飾后卻能免受 TNF誘導(dǎo)的降解 , 使 NFκB- IκB- SUMO復(fù)合體繼續(xù)穩(wěn)定的存在于胞漿中 , 進(jìn)而抑制 NFκB的轉(zhuǎn)錄活性 。 SUMO的生物學(xué)功能 1, 調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用 2, 調(diào)節(jié)蛋白在核漿間的轉(zhuǎn)運(yùn) 3, 調(diào)節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性 4, 拮抗泛素化,使蛋白穩(wěn)定 IκB是 SUMO的一個(gè)底物蛋白 , 它 既能發(fā)生 SUMO化 , 又能發(fā)生泛素化 , 而且由于 SUMO化和泛素化的位點(diǎn)都是 K21, SUMO會(huì)和泛素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn) 。 甘氨酸殘基 Positive charged Negative charged Nterminal Positive charged 甘氨酸殘基 C末端殘基 C末端殘基 當(dāng) SUMO被 E1活化酶活化時(shí),其碳端的苷氨酸殘基發(fā)生 ATP供能的腺甘酸化;隨后,在 SUMO的碳端和 E1的絲氨酸殘基形成一個(gè)硫脂的結(jié)合,并釋放出 AMP。 SUMO1的三級(jí)結(jié)構(gòu)包括一個(gè)與泛素同源區(qū)域( 氨基酸序列 22- 97) 。 SUMO化( sumoylation)的功能與泛素化 (ubiquitination)不同,它并不使蛋白降解,反而加強(qiáng)它們的穩(wěn)定性或調(diào)節(jié)它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的定位和分布 . SUMO家族成員包括 SU
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