現(xiàn)代細胞生物學(xué)研究方法學(xué)生(文件)
【正文】 2，磷酸化改變了轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的空間構(gòu)象 。 2，激酶催化的磷酸化可以被磷酸酶所逆轉(zhuǎn)。 磷酸化研究方法 ? 特異性磷酸化抗體直接證明 ? CIAP或 OA間接證明 ? 片段缺失突變和點突變直接證明 ? 同位素標(biāo)記 ? 質(zhì)譜分析 CIAP或 OA處理細胞證明蛋白磷酸化 CIAP：牛小腸堿性磷酸酶，能夠?qū)?DNA以及蛋白上的磷酸根基團去除（孵育蛋白）； OA：岡田酸，磷酸酶抑制劑（細胞處理） 片段缺失突變確定磷酸化的初步位點 點突變確定磷酸化的精確位點 (For Erk/MAPK) AKT: RXRXXS TR3: RDHLAS Motif 原理：將未被磷酸化的蛋白與被磷酸化后的蛋白用蛋白酶水解后，進行 MS/MS分析，到數(shù)據(jù)庫進行比對。 ? 如果突變導(dǎo)致錯誤的激活去乙?；富蝈e誤的和去乙酰化酶相互作用，將可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。 ? 蛋白乙?；淖饔檬蔷S持染色質(zhì)的開放結(jié)構(gòu)，因而有利于轉(zhuǎn)錄因子與靶 DNA結(jié)合，進而促使基因的轉(zhuǎn)錄。 蛋白入核轉(zhuǎn)運 ? 分子量小于 4550KD的蛋白：在不需要外界能量供應(yīng)的前提下可以通過核孔自由進出（被動擴散）； ? 分子量大于 50KD的蛋白：①依賴于能量和溫度；②需要胞漿運輸因子；③需要核孔復(fù)合體蛋白（主動運輸）； 核定位序列 （ nuclear localization sequence, NLS） ? ① 單一型 NLS，由一段連續(xù)的堿性氨基酸順序排列而成 （ RKKKRKV） ? ②雙分型 NLS，由兩簇堿性氨基酸被中間 10－ 12個非保守性氨基酸所分隔而形成 （ KRPAATKKAGQAKKKKLDK） protein importin? protein importin? importin? protein importin? importin? cytoplasm NPC importin? protein importin? Nucleus nucleoprotin IBB IBB GTPase Ran/TC4 蛋白出核轉(zhuǎn)運 核輸出序列（ nuclear exporting sequence, NES） F X表示任意氨基酸 I I X2－ 3表示 2－ 3個任意氨基酸 L X25 L X23 – L L L 亮氨酸 V V 頡氨酸 M甲硫氨酸 M F 苯丙氨酸 I 異亮氨酸 其特征是富含亮氨酸（ Leu），但與 NLS無任何同源性 。 效應(yīng)蛋白： Ran GTPase激活蛋白： RanGAP (細胞質(zhì) ) RanGAP結(jié)合蛋白： RanBP1 和 RanBP2 (細胞質(zhì) 細胞核 ) 鳥嘌呤核苷交換因子： RanGEF（ 也稱 RCC1） 細胞核中 RanGTP再生 核轉(zhuǎn)運因子 2(NTF2)與 RanGDP復(fù)合體到達細胞核時遇到 RanGEF（ 鳥嘌呤核苷交換因子 ） ， 它便將 Ran上的 GDP替換成 GTP。此時 importin?則自由地結(jié)合到其輸出受體 CAS上， CAS和 RanGTP再相互作用形成三聚體復(fù)合物，被轉(zhuǎn)運到胞漿，由此重新 importin ? cycle。 NTF2與 RanGTP無親合力，所以可以釋放在細胞核中。例如： NFKB與其抑制蛋白 IKB NLS的 C端也可能發(fā)生自身折疊而發(fā)生遮蔽效應(yīng)。 ◆ 蛋白激酶磷酸化位點 ：如 SRF蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子 ， 其入核需要 PKA活性 ， 但不是直接被 PKA磷酸化 ， 說明蛋白激酶除了對轉(zhuǎn)錄因子直接磷酸化外 ， 還可能對蛋白入核轉(zhuǎn)運下游的其它蛋白磷酸化 ， 從而間接影響轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)運 。 ◆ 胞漿錨定機制 ：在爪蟾卵細胞 xnf7蛋白中 ， 有一胞漿滯留區(qū) （ CRD） ，具有很強的錨定功能；只有當(dāng) CRD序列上的 P34cdc2位點脫磷酸化后引起 CRD失活 ， 其錨定功能喪失 ， xnf7蛋白才能夠轉(zhuǎn)運入核 。 而 P34cdc2對 NLS磷酸化則抑制蛋白的入核轉(zhuǎn)運。 在胞漿中， RanGTP在 RanGAP/RanBP1的協(xié)助下轉(zhuǎn)換為 RanGDP，然后重新通過 NTF2的介導(dǎo) 進行新一輪的蛋白轉(zhuǎn)運。 蛋白核漿轉(zhuǎn)運模型： 含有典型的 NLS序列的蛋白被 importin?識別，再與 importin?結(jié) 合形成三聚體，并通過 importin?靶向核孔完成蛋白轉(zhuǎn)運過程。 為出核過程提供能量的仍然是 NPC上的 GTPase Ran/TC4。 ? 而帶正電荷的賴氨酸殘基與 DNA之間的相互作用可限制核小體在 DNA之間的移動，使啟動子接近轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，組蛋白低乙?；谷旧|(zhì)失去轉(zhuǎn)錄活性。 MeCP2突變導(dǎo)致 Rett綜合征，患者出生即發(fā)病、智力發(fā)育遲緩、伴孤獨癥。 質(zhì)譜分析蛋白磷酸化 乙?；惓Ｅc疾病 ? CBP/p300的突變導(dǎo)致 Rubinstein Taybi綜合征，患者智力低下、面部畸形、姆指和拇趾粗大、身材矮小。 4，同一種激酶或磷酸酶都是多底物的，對不同轉(zhuǎn)錄因子的影響不同。 4，增加蛋白質(zhì)分子表面的負電荷。 3）調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)與其他因子的作用。 但是當(dāng) IκB被 SUMO修飾后卻能免受 TNF誘導(dǎo)的降解 ， 使 NFκB－ IκB－ SUMO復(fù)合體繼續(xù)穩(wěn)定的存在于胞漿中 ， 進而抑制 NFκB的轉(zhuǎn)錄活性 。 SUMO的生物學(xué)功能 1, 調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用 2, 調(diào)節(jié)蛋白在核漿間的轉(zhuǎn)運 3, 調(diào)節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性 4, 拮抗泛素化，使蛋白穩(wěn)定 IκB是 SUMO的一個底物蛋白 ， 它 既能發(fā)生 SUMO化 ， 又能發(fā)生泛素化 ， 而且由于 SUMO化和泛素化的位點都是 K21, SUMO會和泛素競爭結(jié)合位點 。 甘氨酸殘基 Positive charged Negative charged Nterminal Positive charged 甘氨酸殘基 C末端殘基 C末端殘基 當(dāng) SUMO被 E1活化酶活化時，其碳端的苷氨酸殘基發(fā)生 ATP供能的腺甘酸化；隨后，在 SUMO的碳端和 E1的絲氨酸殘基形成一個硫脂的結(jié)合，并釋放出 AMP。 SUMO1的三級結(jié)構(gòu)包括一個與泛素同源區(qū)域（ 氨基酸序列 22－ 97） 。 SUMO化（ sumoylation）的功能與泛素化 (ubiquitination)不同，它并不使蛋白降解，反而加強它們的穩(wěn)定性或調(diào)節(jié)它們在細胞內(nèi)的定位和分布 . SUMO家族成員包括 SU
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