【正文】 菌種接種于上述培養(yǎng)基中，于 37℃培養(yǎng)。在培養(yǎng)液中加入一滴甲基紅試劑，紅色為甲基紅試驗陽性反應(yīng)，黃色為陰性反應(yīng) (因甲基紅變色范圍 紅 黃 )。在普通光下檢查非熒光色素，在紫外光下檢查熒光色素。與空白管對照比較，如培養(yǎng)基顏色保持原有顏色，則表示該菌不能利用某種糖；如培養(yǎng)基變黃色，則表明該菌能分解某種糖產(chǎn)酸；如如培養(yǎng)基變黃色而且杜氏小管內(nèi)有氣泡，表示該菌能分解糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。 將菌株保存在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上備用，使用時轉(zhuǎn)至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上活化。 病原該病原經(jīng)鑒定為甘藍(lán)黑腐黃單胞桿菌引起。病菇的另一顯著特點是菌柄基部 , 均帶有較多的泥團(tuán)。 發(fā)病癥狀初期在菌蓋邊緣出現(xiàn)水漬狀 , 后期遍及整個菌 蓋乃至菌柄 , 子實體漸變褐 , 有時菌蓋邊緣向內(nèi)翻卷 , 整個子實體似水燙傷 , 逐漸軟腐 , 很粘 , 濕度大時 , 菌蓋上可見乳白色菌濃。 發(fā)病癥狀 局限于菌蓋上 , 菌蓋初期出現(xiàn)水漬狀小斑點 , 漸漸變成黃褐色并擴(kuò)大成小斑 , 不規(guī)則 , 凹陷 , 凹陷處呈棕褐色。其中英國學(xué)者 和 連續(xù)發(fā)表多篇論文， 包括用人工接種方法確定菇蕾表面形成菌落的細(xì)蔭數(shù)量和菇蕾直徑大小與癥狀出現(xiàn)的關(guān)系、多種殺菌劑對病原細(xì)菌的作用及其對子實體的毒害、次氯酸鈉防治細(xì)菌性斑點病的有效濃度等。 課題國外研究狀況 細(xì)菌性病害的報道最早是 1926年，但病原的確定則在 30 年代初， Bull首先鑒定了蘑菇細(xì)菌性斑點病的病原菌為托拉斯熒光假單孢桿菌 。杏鮑菇以其“香味濃郁似杏仁、味道鮮美如鮑魚一而得名，子實體碩大粗壯、營養(yǎng)豐富、菌柄潔白、菌肉肥厚、質(zhì)地脆嫩，既可保鮮加工，又可與魚、肉等合一烹飪，是近年來中國重點開發(fā)的珍稀菇種之一 [1]。 葡萄糖氧化發(fā)酵作用的測定 ......................................................... 錯誤 !未定義書簽。 主要培養(yǎng)基 ..................................................................................... 錯誤 !未定義書簽。根據(jù)革蘭氏染色和生化檢驗結(jié)果，初步鑒這 兩個 菌株為假單胞菌 屬 。進(jìn)一步 對其生理生化特性，分析 16SrRNA 序列 ，鑒定 S1 為 Pseudomonas putida， S2 為Pseudomonas marginais。 病原菌的分離純化 ............................................................................... 錯誤 !未定義書簽。 氧化酶 ............................................................................................................................. 4 色素的產(chǎn)生 ..................................................................................................................... 4 接觸酶 ............................................................................................................................. 4 甲基紅試驗（ ） ............................................................................................. 5 乙酰甲基甲醇試驗（ ） ................................................................................... 5 產(chǎn)生吲哚試驗 ................................................................................................................. 5 水解七葉靈 ..................................................................................................................... 6 明膠水解 ......................................................................................................................... 6 水解淀粉 ....................................................................................................................... 6 反硝化作用 ................................................................................................................... 7 常熟理工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文） IV 硝酸鹽還原試驗 ........................................................................................................... 7 碳源的利用 ................................................................................................................... 8 卵磷脂酶測定 ............................................................................................................... 8 精氨酸雙水解反應(yīng) ....................................................................................................... 8 運動性的檢查 ....................................................................................... 錯誤 !未定義書簽。 近年在杏鮑菇工廠化生產(chǎn)過程中出現(xiàn)了嚴(yán)重的污染菌，有些菇農(nóng)種植的杏鮑菇其污染率超過了 50％以上，杏鮑菇生產(chǎn)因污染菌造成的損失達(dá)億元以上。后來美國、法國、丹麥、英國、德國、荷蘭、澳大利亞等國相繼報道，并推廣用漂白粉水溶液進(jìn)行防治。比利時學(xué)者 M． GOOT 等人應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)對分離到的 20 多個菌株進(jìn)行了比較鑒定后分成 7 個類型。濕度大時 , 凹斑內(nèi)有粘稠的菌液 , 當(dāng)病斑干后 ,菌蓋往往開裂。 病原據(jù)鑒定 , 細(xì)菌性軟腐病是由一種螢光假單胞桿菌引起。 病原該病由一種假單孢桿菌引起。 課題主要研究內(nèi)容 從杏鮑菇生產(chǎn)廠（昆山正興食用菌有限公司）中污染的 生產(chǎn)包 分離純化，得到純菌落；查閱資料，做相關(guān)的生理生化實驗；提取相關(guān)基因，測序，比對，鑒定實驗菌的種類；查閱相關(guān)資料，考察不同的抗生素對實驗菌的藥性，找出對該實驗菌的防治措施。 病原菌的 形態(tài)觀察及染色 將 病原菌 在 牛肉膏 蛋白胨 培養(yǎng)基上 30℃培養(yǎng) 24 h 后， 觀察 牛肉膏蛋白胨 平板菌落形態(tài)、 牛肉膏蛋白胨 斜面菌苔形態(tài)、肉汁凍液體培養(yǎng)基中的生長情況。 常熟理工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文） 4 氧化酶 直接在菌苔上滴加 鹽酸二甲基對苯二胺 (或鹽酸對氨基二甲基苯胺 )1％水溶液 ，不可過濕。 接觸酶 將測定菌按種于適宜的斜面上，適溫培養(yǎng) 1824h 取一環(huán)培養(yǎng) 1824h 的菌苗涂于于凈的載破片上，然后滴上一滴 310％的過氧化氫 ，若有氣泡 (氧氣 )，則為接觸酶陽性反應(yīng)，無氣泡為陰性反應(yīng)。 常熟理工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文） 5 乙酰甲基甲醇試驗（ ） 培養(yǎng)基：蛋白胨 5g，葡萄糖 5g， K2HPO4 5g，水 1000ml， ，每管分裝 45ml 接種試驗菌于以上培養(yǎng)液中，每次 2 個重復(fù)，置適溫培養(yǎng) 2d． 6d。 培養(yǎng) 7d 的培養(yǎng)液，沿管壁緩緩加入 毫升的乙醚至培養(yǎng)液，充分震蕩，使乙醚分散于液體中，將培養(yǎng)液靜置片刻，待乙醚浮至液面后再加吲哚試劑。產(chǎn)黑褐色色素者為陽性，不產(chǎn)黑褐色素者為陰性。如明膠凝塊部分或全部在 20℃以下變?yōu)榭闪鲃拥囊后w，則為明膠水解陽性。取新鮮種菌點種，適溫培養(yǎng)。培養(yǎng) 1～ 7d，觀察含有硝酸鉀的培養(yǎng)基中有無氣泡，如產(chǎn)生氣泡表示有反硝化作用產(chǎn)生氨氣，是陽性反應(yīng)；如不含硝酸鉀的對照培養(yǎng)基也產(chǎn)生氣泡則只能按可疑或陰性處理，不產(chǎn)生氣泡為陰性。結(jié)果觀察：當(dāng)培養(yǎng)液中滴入 A、 B 液后，溶液如變?yōu)榉奂t色、玫瑰色、橙色、棕色等表示亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性。 用菌體懸液，每一個測定菌都須接種未加合碳化合物的空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照。如兩種培養(yǎng)基上的生長情況差別不明顯，可在同一培養(yǎng)基上連續(xù)移種三次。 取 1824h 的斜面或培養(yǎng)液中的菌體點種在上述平板上。培養(yǎng)基轉(zhuǎn)為紅色者為陽性，應(yīng)有不含精氨酸空自做對照。如生良物只生長在穿刺線上，邊緣十分清晰，則表示試驗菌無運動性。如 2— 3 天時 仍不能明確判定是否有運動性，可延遲到 5— 6 天再觀察一次。如試驗菌品好癢細(xì)菌．穿刺線上生長物很少，可檢常熟理工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文） 8 查從培養(yǎng)基表面向下滲入的生長物的情況。 測序 常熟理工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文） 9 以 Seq Forward、 Seq Internal 和 Seq Reverse 為引物進(jìn)行 DNA 測序。 常用抗生素抗性試驗 采 用 濾紙片 法，以抑菌圈的大小，測定殺菌效果。 3．結(jié)果與分析 污染杏鮑菇樣本的性狀描述 圖 1 菌絲包和菇體樣本污染圖 The sample figure of pollution during mycelial and fruiting bodies growth 從圖 1 可以看出，污染杏鮑菇的樣本在菌絲生長階段，在料袋上出現(xiàn)零星的黃色水珠，黏度不大，這一現(xiàn)象導(dǎo)致菌絲長滿袋的時間延長 57d；且這現(xiàn)象一般出現(xiàn)在袋口附近，緩慢向下蔓延至整個料包的 1/4 為止。 污染病 原 菌的分離 分別挑去菌絲料包上的水珠和污染菇體，進(jìn)行涂布培養(yǎng)。參照《伯杰氏 細(xì)菌鑒定手冊 第八版》和《常見細(xì)菌鑒定手冊》[7,9]，斷定菌株 S1 為假單胞菌屬的細(xì)菌。參照上述細(xì)菌分類鑒定手冊對假單胞菌的鑒定方法，進(jìn)行了其他生理生化試驗，并和 Pseudomonas 的細(xì)菌進(jìn)行比較，結(jié)果見表 表 菌株 S2 的生理生化測定結(jié)果 實驗項目 S2 pv. marginalis pv. pastinacae 氧化分解葡萄糖 + / / 常熟理工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文） 18 氧化酶 + + + 接觸酶 + + + 精氨酸雙水解酶 + + + 還原硝酸鹽反應(yīng) + + + 明膠液化 + + + 乙醇氧化 / / 碳源的利用 D葡萄糖 + + + D蔗糖 + + + D甘露醇 棉子糖 + + L丙氨酸 + / / 生長溫度 41℃ + + + 4℃ 產(chǎn)生吲哚試驗 / / 反硝化作用 / / 淀粉水解