【正文】 (cenulosome)[10]，具有多種功能的超分子結(jié)構(gòu)。 酶活較強(qiáng)的菌種有纖維桿菌屬 (Culmolnoas)、生孢纖維菌屬 (sporocytophaga)[7]和梭菌屬 (cellulomonas)。據(jù)估計(jì)，纖維素水解成葡萄糖所需的酶蛋白要比淀粉相應(yīng)水解所需的酶蛋白多 100 倍，這是影響纖維素酶實(shí)際應(yīng)用的重要原因之一 [5]。由于酒糟酸度 偏 大，可生化性 較較 強(qiáng)，極易腐爛，不便存儲(chǔ)，若不及時(shí)處理，易對(duì)環(huán)境造成極大的污染 [2]。通過不同溫度分離篩選條件下得到的菌株分別在其對(duì)應(yīng)溫度下的生長(zhǎng)曲線 可以看出 ， 高溫 振蕩 培養(yǎng)的菌株會(huì)在試管表面長(zhǎng)出菌苔，菌液澄清，試管底部有沉淀；中溫靜置培養(yǎng)條件下的菌株菌液整體渾濁，分布均勻。 在這 103株菌中， 產(chǎn)透明圈半徑大于 cm（ 30℃）和 cm（ 50℃）的菌株有 20株 。畢業(yè) 論文（設(shè)計(jì)） 中凡引用他人已經(jīng)發(fā)表或未發(fā)表的成果、數(shù)據(jù)、觀點(diǎn)等，均已明確注明出處。 特此聲明。 本試驗(yàn) 分別從 50176。高溫振蕩培養(yǎng)的菌株在培養(yǎng)前期（ 12 h） 生長(zhǎng)快于低溫 靜置 培養(yǎng) 的菌株 ，但 培養(yǎng) 3 d后，二者 生長(zhǎng)趨勢(shì) 趨向 一致，但中溫 條件下篩選的部分菌株（ BL5106）性能優(yōu)于 高溫 條件下篩選得到的菌株。 酒糟生物質(zhì)主要由 纖維素和木質(zhì)素 構(gòu)成 ，同時(shí)含有一定的殘余糖分、淀粉、粗脂肪和蛋白質(zhì) [3]，因此 ， 可利用具有降解纖維素的菌種對(duì)其進(jìn)行分解，把其中部分纖維素轉(zhuǎn)化為有機(jī)質(zhì)等，從而提高酒糟的綜合利用效率 [4]。因而，篩選纖維素酶比活力高的菌株無疑具有重要的意義。研究最多的是纖維單胞菌（ Cellulomonas） [89]和熱纖梭菌（ Clostridium thermocellum）。纖維小體附著在細(xì)菌細(xì)胞表面，所以細(xì)菌需要粘附在纖維上，使纖維小體在纖維的接觸點(diǎn)處對(duì)纖維素進(jìn)行水解，如熱纖梭菌（ Clostridium thermocellum）。最適產(chǎn)酶條件為：發(fā)酵時(shí)間 72~ 96 h，發(fā)酵溫度 25~ 30176。 秦廣利等 [13]在酒糟中提取酒的研究也有了新發(fā)現(xiàn)，結(jié)果表明， 在殘?jiān)阒刑砑永w維素酶 10 U/g，于 58176。 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 3 頁 2 材料與方法 供試樣地區(qū)域概況 樣品來源地 茅臺(tái) 鎮(zhèn)位于仁懷市 赤水河 畔，是茅臺(tái)酒、文臺(tái)酒的故鄉(xiāng)。茅臺(tái)鎮(zhèn)被數(shù)目龐大的特殊微生物群籠罩其中，正是它們充當(dāng)了釀酒業(yè)的主力軍。 因?yàn)槲⑸镌囼?yàn)的主要對(duì)象是微生物，其中空格部分的理化性質(zhì)是無需檢測(cè)的指標(biāo)，理化性質(zhì)只是作為最后結(jié)果的一個(gè)比較參考 。C 和 50176。3H2O g、 MgSO4 5． 濾紙 崩解 培養(yǎng)基：蛋白胨 g、酵母膏 g、 NaCl g、蒸餾水 mL、調(diào) pH ，每 mL 培養(yǎng)基加入 mL 試管中，再加入濾紙（ 1cm6cm）。 7．纖維素分解細(xì)菌產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液：羧甲基纖維素鈉 、 MgSO4 以上培養(yǎng)基于 121176。量取 0. 1 mol / L 檸檬溶液 89. 5 mL， 0. 1 mol/ L檸檬酸三鈉溶液110. 5 mL，混勻，即得 pH 4. 8 0. 1 mo l/ L的檸檬酸緩沖液。 5．葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶 液的配制：將葡萄糖放在 110 176。 7．革蘭氏碘液：碘 g、 碘化鉀 g、蒸餾水 mL，將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至 mL。 觀察培養(yǎng)皿上菌落形成情況，選取優(yōu)勢(shì)菌株和透明圈明顯的菌株， CMCNa培養(yǎng)基上用兩區(qū)劃線培養(yǎng)進(jìn)行分離和純化 。C 、 50176。C 條件下保存， 以作下一步的研究 [15]。 用 721G可見分光光度計(jì)，在 660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定 吸光度 。取出后置于冷水浴中冷卻，在 721G 型分光光度計(jì)上比色。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)， 吸光度 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。C 則在 120 r /min下振蕩培養(yǎng) 24 h，不同處理做 3個(gè)重復(fù)。在 520 nm 處測(cè) OD 值，測(cè)得 OD 值后查閱葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出酶解所得葡萄糖含量，換算成酶活力值。 觀察其酶活力的分解強(qiáng)度，以 +、 — 標(biāo)示作用情況，本方法是以肉眼觀察為主，主觀意識(shí)為主，結(jié)果的表示只能為試驗(yàn)提供參考，不能作評(píng)判的依據(jù)，但用于篩選目標(biāo)菌株有很大的適用性，再配以其他方法，不是為有效的手段。還原糖的測(cè)定：取刻度試管 26 只，個(gè)加入稀釋酶液 mL， CMC 緩沖液（檸檬酸緩沖液） mL。C 和 30176。迅速冷卻試管，并加蒸餾水定容至 mL。 葡萄糖量 = [(mg/mL)?30 min] 1/10 式中 葡萄糖量 ： 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查的 （ mg）； 1/10： 稀釋倍數(shù)； 30： 糖化時(shí)間（ min）。 菌株初篩 結(jié)果 初篩情況統(tǒng)計(jì) 通過對(duì)近千個(gè)菌株的初篩，用 羧甲基纖維素鈉鑒定培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，滴加革蘭氏碘液有透明圈的 244 株。C 培養(yǎng)條件下的，選取透明圈半徑超過 2 cm，透明圈與菌落半徑比值大于 3 的 7 株菌； 30176。 其中 BL5581是在純化 BL558時(shí)被發(fā)現(xiàn)的，后來發(fā)現(xiàn)透明圈半徑比 : BL558更大，就一直以此命名。C 3d BH331 50176。C 3d BH634 50176。C 3d BL595 30176。保存在 4176。 圖 短期平板 保存培養(yǎng)基 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果 測(cè)定生長(zhǎng)曲線所用到的波段沒有固定的要求，經(jīng)過具體的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在波長(zhǎng)較小的情況下（ 440nm）所測(cè)定的值會(huì)大于較高的值（ 660nm），這要求根據(jù)菌懸液的濁度調(diào)整相對(duì)較佳的值，當(dāng)菌懸液濁度教小時(shí)用低波段測(cè)定，反之用高波段測(cè)定，最好將最后測(cè)定的最大值控制在 之內(nèi)。C 、 120 r /min 振蕩培養(yǎng) 下的菌懸液，沉淀量大、液體中分布有絮狀物、液面有菌苔生長(zhǎng)、液體中顆粒物分布不均勻 、液體顏色呈清透亮、細(xì)菌生長(zhǎng)情況很難判明。 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 13 頁 表 中記錄的數(shù)值， 50176。C 、120 r /min 振蕩培養(yǎng) 下的菌懸液吸光度偏離真實(shí)值， 為減少累贅，在這里只列表，不繪制曲線。C 、 3500 r / min 離心 15 min， 取上清液作為粗酶液，測(cè)其對(duì)濾紙分解度， CMC 酶活力 ( CMCase )。 表 葡萄糖 吸光度 (OD520nm) 管號(hào) 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液中所含葡萄糖量（ μg） OD 值 1 100 2 200 3 300 4 400 5 500 6 600 圖 是 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的 DNS 顯色反應(yīng)圖片，與圖 可作為一個(gè)直觀的對(duì)比方式，通過對(duì)比不難發(fā)現(xiàn) CMC 酶活大體數(shù)值。 濾紙這種非天然纖維素底物化學(xué)組成均一、試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，是普遍選用的篩菌底物，但用其進(jìn)行的纖維素酶活性檢測(cè)不能真實(shí)地反映菌株對(duì)酒糟這類復(fù)雜組分的纖維素的降解能力。 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 17 頁 4 結(jié)果與 討 論 從茅臺(tái)酒廠提供的樣品中分離到近千株菌，經(jīng)過革蘭氏碘液染色，共得到能產(chǎn)生透明圈的菌株 244株， 其中，有 4株菌菌落半徑達(dá)到 cm， BL595透明圈與菌落半徑比值最大的達(dá)到 15，透明圈與菌落半徑比值超過 10的有 12株，透明圈與菌落半徑比值超過 5的有 103株。 通過濾紙的崩解試驗(yàn)找到重點(diǎn)目標(biāo)，最后， CMC 酶活和 FPA 酶活研究結(jié)果表明，這 13 株菌在分泌纖維素酶活力及降解濾紙能力方面， BL5106，不管是從其一開始的生長(zhǎng)速度（生長(zhǎng)曲線），對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力（濾紙崩解），還是對(duì)CMC 的分解能力都顯得尤為凸出。C 和 50 176。 在震蕩條件下培養(yǎng)，菌體懸浮液面生長(zhǎng)，并連接成團(tuán)，沒有均勻散開，所以雖然在培養(yǎng)后期（ 2d），以肉眼可見大量聚集成團(tuán)的菌落，但 吸光度 變同時(shí)間沒有相關(guān)性。 另外，同一菌種分小批分別接種培養(yǎng)的方式最后得出的數(shù)值存在較大誤差，若同一菌接種到 250 mL的三角瓶中，在不同時(shí)間段取液保存測(cè)定可能更為直觀，因?yàn)橹昃纳L(zhǎng)環(huán)境變化不大，也沒有隔離。 1984 年，國際理論和應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(huì)的發(fā)酵委員會(huì)確認(rèn)濾紙酶活力測(cè)定法為標(biāo)準(zhǔn)方法。更為主要的是這種方法的反應(yīng)時(shí)間比較長(zhǎng)，不利于快速測(cè)定，這在生產(chǎn)中是很不方便的 [18]。 在通常情況下，影響酶活力的因素較多，如酶的濃度、底物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)、pH 值、 反應(yīng)溫度等。產(chǎn)纖維素酶酶活和濾紙酶活高的菌株分解酒糟的效率不一定好。 從確定指導(dǎo)老師的那 一刻開始，我和平京很是興奮了一陣，因?yàn)?未來的 指導(dǎo)老師， 是 剛來我們學(xué)院的易維潔博士，易老師的學(xué)識(shí)及為人是我們 激勵(lì)我們的源頭。我們?cè)O(shè)計(jì)思路，制定方案，清洗儀器，準(zhǔn)備 器材，同時(shí)實(shí)驗(yàn)室也迎來了第一批客人，茅臺(tái)酒廠派來的 “ 監(jiān)工 ” ，我們一起開始了菌種的分離。也許是一開始的期待太大，所以會(huì)對(duì)結(jié)果失望吧！ 在本論文完成之際，我要向所有幫助過我的老師、同學(xué)表示衷心的感謝！ 但我最想 感謝的是我的導(dǎo)師， 您的嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)心，負(fù)責(zé)溫和感染了我，這份影響很珍貴！ 謝謝您！易老師！ 。 而事實(shí)證明 ，沒有足夠的努力，就不會(huì)有最好的結(jié)果。 接下來， 抱著極大熱情與期待投入到了 試驗(yàn)之中 ， 我們整理實(shí)驗(yàn)室，將每一件物品擺設(shè)好，當(dāng)看到起初凌亂不堪的實(shí)驗(yàn)室為之煥然一新 時(shí)，很是給 我們 加 了把勁 ，即使我們還缺少設(shè)備，但至少我們 擁有了南區(qū)最好的實(shí)驗(yàn)室。 通過以上試驗(yàn)，對(duì)所篩選的細(xì)菌有做了進(jìn)一步的淘汰，在得到 1株較為高效的纖維素分解菌的同時(shí)，也建立了初步的探究模式，這為 下一步的工作創(chuàng)造了便利。 還有纖維素酶酶系組成和纖維素的結(jié)構(gòu)對(duì)分解纖維素的效果有明顯的影響。經(jīng)高溫蒸餾的酒糟中纖維素的晶狀結(jié)構(gòu)被部分破壞，有利于纖維素酶的作用。在近來的總酶活力測(cè)定過程中發(fā)現(xiàn)，國產(chǎn)濾紙的質(zhì)量有所變化，其本底值過高，給測(cè)定帶來 較大的誤差，而且作為底物的濾紙需要裁成一定重量的小條，比較麻煩。這說明纖維素的有效分解需要多菌種分泌多種酶的協(xié)同參與。C 靜置條件下培養(yǎng)，菌懸液散步較均勻，長(zhǎng)期培養(yǎng)下（ 4d）除 BL599 和 BL5106 外，其余菌液管液面上均有稀薄的一層菌落。C 條件下篩選的部分菌株（ BL5106）性能優(yōu)于 50 176。通過各細(xì)菌生長(zhǎng)曲線可以看出，在條件適宜的情況下，前期（ 1d）細(xì)菌群落生長(zhǎng)便已趨于穩(wěn)定，隨著時(shí)間的推移，有小幅變化，在培養(yǎng)的中期（ 4d） ，便有部分菌株進(jìn)入了衰落期，菌懸液的 OD出現(xiàn)下滑趨勢(shì)，但總體趨勢(shì)并沒有變化。C條件篩選的 7株和 30 176。 下 圖 一組 以 LB去除碳源為培養(yǎng)液，添加濾紙作為唯一碳源，接種一環(huán)連續(xù)培養(yǎng) 5d后，培養(yǎng)液及濾紙的出現(xiàn)的一些直觀情況，以此可作為挑選菌株的參考依據(jù)。 結(jié)合生長(zhǎng)曲線測(cè)定的 OD可以推斷，液體渾濁度高的相對(duì)的 OD就大，對(duì)濾紙的分解能力相應(yīng)也會(huì)較強(qiáng)。 貴