【正文】 136 等菌株已經(jīng)溶源化 cI 857(ts) l 噬菌體 ， 可用作表達(dá)外源基因時(shí)的宿主菌 。由于通過(guò)細(xì)胞因子來(lái)控制 cI 基因產(chǎn)物的產(chǎn)生和消失是相當(dāng)困難的。 PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng) 以 l 噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子 PL 、 PR 為核心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) 在野生型 l 噬菌體中 ， PL 、 PR 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄與否決定了 l 噬菌體進(jìn)入 裂解循環(huán)還是溶源循環(huán) 。 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理 色氨酸啟動(dòng)子 Ptrp 受色氨酸 阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏 ， 轉(zhuǎn)錄呈基底 狀態(tài) 。 用乳糖替代 IPTG 誘導(dǎo) lac 和 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄 乳糖在 b半乳糖苷酶作用下生成異乳糖 ， 異乳糖具有誘導(dǎo)劑的作用 這一過(guò)程涉及乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化 ， 其效率受到多種因素的影響和制約 因此乳糖誘導(dǎo)的有效劑量大大高于 IPTG。 lac、 tac 表達(dá)系統(tǒng)存在的問(wèn)題 IPTG 用于誘導(dǎo) lac、 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄 ， 但由于 IPTG 本身具有一定的 毒性 。 lac、 tac 啟動(dòng)子對(duì)宿主菌的要求 為了使以 Lac、 Tac 表達(dá)系統(tǒng)具有嚴(yán)緊調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄的能力 ， 一 種 能產(chǎn)生過(guò)量的 LacI 阻遏蛋白 的 lacI 基因的突變體 lacIq 被應(yīng)用于表 達(dá)系統(tǒng) 。 lac、 tac 啟動(dòng)子對(duì)宿主菌的要求 在普通大腸桿菌中 ， LacI 阻遏蛋白僅能滿足細(xì)胞染色體上 lac 操縱子 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的需要 。 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA RNA 聚合酶 基底水平轉(zhuǎn)錄 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA 高效轉(zhuǎn)錄 RNA 聚合酶 IPTG mRNA 第九頁(yè)，共八十七頁(yè)。 RNA 聚合酶 RNA 聚合酶 cAMP 葡萄糖代謝 cAMP濃度降低 cAMP CAP CAP 第七頁(yè)，共八十七頁(yè)。 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) 外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理 啟動(dòng)子 終止子 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 密碼子 質(zhì)粒拷貝數(shù) 轉(zhuǎn)錄 翻譯 第四頁(yè)，共八十七頁(yè)。外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) 第一頁(yè)，共八十七頁(yè)。 P tac = 3 P trp = 11 P lac 啟動(dòng)子 第五頁(yè)，共八十七頁(yè)。 Lac 表達(dá)系統(tǒng) lac UV5 突變體 Plac UV5 突變體能夠在沒有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 轉(zhuǎn)錄 ， 受它控制的基因 在轉(zhuǎn)錄水平上只受 lacI 的調(diào)控 ， 因此用它 構(gòu)建的表達(dá)載體在使用時(shí)比野生型 Plac 更易操作 。 Tac 表達(dá)系統(tǒng) tac 啟動(dòng)子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的雜 合啟動(dòng)子 。 當(dāng)多拷貝的 lacO 隨著帶有 lacUV tac 啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入 大腸桿菌后 ， LacI 阻遏蛋白與 lacO 的比例顯著下降 ， 無(wú)法保證每一 個(gè) lacO 都能獲得足夠的 LacI 阻遏蛋白參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控 。 大腸桿菌 JM109 等菌株的基因型均為 lacIq ， 常被選用為 Lac、 Tac 表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌 。 從平安角度 ， 對(duì)表達(dá)和制備用于醫(yī)療目的的重組蛋白并不適合 。 乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用 ， 較多的乳糖存在也 會(huì)導(dǎo)致菌體生理及生長(zhǎng)特性變化 。 在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸或者參加 3吲哚丙烯酸 〔 IAA〕 ， 便可有 效地解除阻遏抑制作用 。 啟動(dòng)子 第十七頁(yè)，共八十七頁(yè)。 因此 PL 、 PR 表達(dá)系統(tǒng)都選用溫度敏感突變體 cI 857(ts) 的基因產(chǎn)物 來(lái)調(diào)控 PL 、 PR 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。 把 cI 857(ts) 基因組裝在表達(dá)載體上 宿主菌選擇范圍更大 第十九頁(yè)，共八十七頁(yè)。 第二十頁(yè)，共八十七頁(yè)。 并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌 RNA聚合酶有效轉(zhuǎn) 錄的序列 。 化學(xué)誘導(dǎo)型 溫度誘導(dǎo)型 雙質(zhì)粒系統(tǒng) T7 RNA 聚合酶 T7 啟動(dòng)子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因 ？ 啟動(dòng)子 第二十三頁(yè)，共八十七頁(yè)。 這種方式可以使本底轉(zhuǎn)錄降到 很低的水平 ， 尤其適用于表達(dá) 對(duì)大腸桿菌宿主有毒性的重組 蛋白質(zhì) 。 解決方法之一 在表達(dá)系統(tǒng)中低水平表達(dá) T7 溶菌酶基因 。 營(yíng)養(yǎng)調(diào)控型 采用大腸桿菌堿性磷酸酯酶基因 phoA 啟動(dòng)子或甘油 3’ 磷酸轉(zhuǎn)移系 統(tǒng) ugp 啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體。 這兩個(gè)啟動(dòng)子受葡萄糖抑制，巖藻糖和阿拉伯糖是它們的誘導(dǎo)物?！苍?pH﹥ 8 時(shí)抑 制， pH ﹤ 6時(shí)激活， pH = 6時(shí)轉(zhuǎn)錄活力最高〕。 在富氧條件下轉(zhuǎn)錄被抑制 ， 在貧氧或微氧條件下轉(zhuǎn)錄被激活 。 其他表達(dá)系統(tǒng) 第三十二頁(yè)，共八十七頁(yè)。 強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性 外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過(guò)頭現(xiàn)象，即 RNA 聚合酶滑過(guò)終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的 DNA 序列，形成長(zhǎng)短不一的 mRNA 混合物過(guò)長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會(huì)影響外源基因的表達(dá)，其原因如下： 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長(zhǎng)， RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子 mRNA 所需的時(shí)間就相應(yīng)增加，外源基 因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降； 如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或 DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo) 記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，那么 RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其 它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性； 過(guò)長(zhǎng)的 mRNA 往往會(huì)產(chǎn)生大量無(wú)用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無(wú)謂的能量消耗； 更為嚴(yán)重的是，過(guò)長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級(jí)結(jié)構(gòu)， 從而大大降低外 源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率 終止子 第三十四頁(yè)，共八十七頁(yè)。 大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的 mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差異有時(shí)可高達(dá)數(shù)百倍。 核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響 SD 序列的影響 一般來(lái)說(shuō)， mRNA 與核糖體的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效率就 越高，而這種結(jié)合程度主要取決于 SD 〔 UAAGGAGG〕序列與 16S rRNA 的堿基互補(bǔ)性，其中以 GGAG 四個(gè)堿基序列尤為重要。 對(duì)于大腸桿菌 b半乳糖苷酶的 mRNA 而言 ， 在這個(gè)位置上最佳答案 的堿基組合是 UAU 或 CUU， 如果用 UUC、 UCA 或 AGG 取代 之 ， 那么酶的表達(dá)水平低 20 倍 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 第四十頁(yè)，共八十七頁(yè)。 除此之外 ， 從 AUG 開始的前幾個(gè)密碼子堿基序列也至關(guān)重要 ， 至 少這一序列不能與 mRNA 的 5’ 端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu) ， 否那么便 會(huì)嚴(yán)重干擾 mRNA 在核糖體上的準(zhǔn)確定位 目前廣泛用于外源基因表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒上 ， 均含有與 啟動(dòng)子來(lái)源相同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列 ， 序列和間隔是最佳答案的 。 一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳答案表達(dá)： 外源基因全合成 同步表達(dá)相關(guān) tRNA 編碼基因 第四十四頁(yè)，共八十七頁(yè)。 目標(biāo)蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的形式有二種： 在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為不溶性的包涵體顆粒 包涵體存在于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中 在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì) 可溶性的目標(biāo)蛋白質(zhì)除可存在于細(xì)胞質(zhì)中外，還可借助于本身的 功能序列和大腸桿菌蛋白質(zhì)加工、運(yùn)輸體系，最終分泌到周質(zhì)空 間，或外泌到培養(yǎng)液中。 富含蛋白質(zhì)的包涵體多見于生長(zhǎng)在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細(xì)胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會(huì)喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 第四十九頁(yè)，共八十七頁(yè)。 包涵體的變性與復(fù)性操作 包涵體的溶解與變性 包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開錯(cuò)配的二硫鍵和次級(jí)鍵。 在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì) 目標(biāo)蛋白以可溶性蛋白質(zhì)形式表達(dá)雖然可以防止包涵體復(fù)性帶來(lái)的問(wèn)題 ， 但是也有一定的缺陷 ， 主要表現(xiàn)為大腸桿菌本身存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)往往只含有少量的 ， 甚至沒有半胱氨酸殘基 。 一些需要通過(guò)二硫鍵的形成來(lái)維持其構(gòu)象的目標(biāo)蛋白在大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中往往不能正確折疊 。個(gè)相當(dāng)重要的工具 。 ⑵ 另外 ， 附加的甲硫氨酸也可能 改變蛋白質(zhì)的免疫性質(zhì)和藥理性質(zhì) 。 ⑵ 在別離純化后在體外用外肽酶處理 。 目標(biāo)蛋白與有親合配基的序列融合表達(dá)既可以提高別離純化的效率，又能在融合蛋白切離的過(guò)程中得到?jīng)]有附加甲硫氨酸目標(biāo)