【正文】 導(dǎo) Ptrp 介導(dǎo)的目的基因表達(dá) 啟動(dòng)子 Trp 表達(dá)系統(tǒng) 以大腸桿菌 trp 操縱子調(diào)控機(jī)理為根底設(shè)計(jì) 、 構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) 第十五頁(yè)，共八十七頁(yè)。 PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng) 以 l 噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子 PL 、 PR 為核心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) 在野生型 l 噬菌體中 ， PL 、 PR 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄與否決定了 l 噬菌體進(jìn)入 裂解循環(huán)還是溶源循環(huán) 。 PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 由 l 噬菌體 PE 啟動(dòng)子控制的 cI 基因的產(chǎn)物是 PL 、 PR 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的 阻遏物。由于通過(guò)細(xì)胞因子來(lái)控制 cI 基因產(chǎn)物的產(chǎn)生和消失是相當(dāng)困難的。 在較低溫度〔 30℃ 〕時(shí)以活性形式存在 在較高溫度〔 42℃ 〕時(shí)失活脫落 第十八頁(yè)，共八十七頁(yè)。 對(duì)宿主菌的要求 用溶源化 l 噬菌體的大腸桿菌作 PL、 PR 啟動(dòng)子表達(dá)載體的宿主菌 N48301， POP2136 等菌株已經(jīng)溶源化 cI 857(ts) l 噬菌體 ， 可用作表達(dá)外源基因時(shí)的宿主菌 。 PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng)存在的問(wèn)題 由于 PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)時(shí)不加化學(xué)誘導(dǎo)劑 ， 本錢又低廉 ， 最初幾 個(gè)在大腸桿菌中制備的藥用重組蛋白質(zhì)都采用 PL 或 PR 表達(dá)系統(tǒng) 。 在大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時(shí) ， 通過(guò)熱平衡交換方式把培養(yǎng)溫度從 30℃ 提高到 42℃ 需要較長(zhǎng)的時(shí)間 ， 這種緩慢的升溫方式影響誘導(dǎo)效 果 ， 對(duì)重組蛋白表達(dá)量有一定的影響 。 第二十一頁(yè)，共八十七頁(yè)。 T7 RNA 聚合酶活性高 ， 其合成 RNA 的速度比大腸桿菌 RNA 聚合 酶快 5倍左右 。 在細(xì)胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬茵體啟動(dòng)子的情形下 ，大腸桿 菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競(jìng)爭(zhēng)不過(guò) T7 噬菌體轉(zhuǎn)錄體系 ， 最終受 T7噬 菌體啟動(dòng)子控制的基因的轉(zhuǎn)錄到達(dá)很高的水平 。 T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 T7 噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄完全依賴于 T7 RNA 聚合酶 ， 因此 T7 RNA 聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式就決定了表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控方式 。 T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 化學(xué)誘導(dǎo)型 噬菌體 是 l 噬菌體的衍生 株 ， 一段含有 lacI、 lacUV5 啟 動(dòng)子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中 用噬菌體 DE3 的溶源菌作為表 達(dá)載體的宿主菌 ， 調(diào)控方式為 ， 類似于 Lac 表達(dá) 系統(tǒng) 。 T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 溫度誘導(dǎo)型 PL 啟動(dòng)子控制 T7 RNA 聚合 酶基因 ， 通過(guò)熱誘導(dǎo)方式激發(fā) T7 噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄 。 PL 啟動(dòng)子 T7 啟動(dòng)子 目的基因 T7 RNA 聚合酶 熱誘導(dǎo) cI857 第二十五頁(yè)，共八十七頁(yè)。 T7 表達(dá)系統(tǒng)存在的問(wèn)題 T7 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的基因的水平是目前所有表達(dá)系統(tǒng)中最高的 ， 但 也不可防止出現(xiàn)在相對(duì)較高的本底轉(zhuǎn)錄 ， 如果目的基因產(chǎn)物對(duì)大腸桿 菌宿主有毒性 ， 會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng) 。 因?yàn)? T7 溶菌酶除了作用于大腸桿菌細(xì)胞壁上肽聚糖外 ， 還能與 T7 RNA 聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄的活性 。 第二十七頁(yè)，共八十七頁(yè)。 這兩個(gè)啟動(dòng)子受在培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)磷〔 Pi〕濃度調(diào)控〔 Pi﹥ 5mmol/L 時(shí)抑制， Pi﹤ 1mmol/L 時(shí)激活 )，具有較高的轉(zhuǎn)錄水平。 糖原調(diào)控型 采用的有大腸桿菌半乳糖轉(zhuǎn)移系統(tǒng)〔 mglBAEC) mgl 啟動(dòng)子或沙門 氏菌阿拉伯糖基因 araB 啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體。 其調(diào)控機(jī)理類似于 Lac 表達(dá)系統(tǒng) . 其他表達(dá)系統(tǒng) 第二十九頁(yè)，共八十七頁(yè)。 cadA 啟動(dòng)子受培養(yǎng)基中 H+ 濃度，即 pH 值調(diào)控。 該表達(dá)系統(tǒng)要求菌體發(fā)酵溫度控制在 27 ～ 30℃ 之間才能使目的基 因得到穩(wěn)定的表達(dá) . 其他表達(dá)系統(tǒng) 第三十頁(yè)，共八十七頁(yè)。 這些啟動(dòng)子中都含有對(duì)氧響應(yīng)的調(diào)節(jié)因子 fnr 的作用位點(diǎn) 。 其他表達(dá)系統(tǒng) 第三十一頁(yè)，共八十七頁(yè)。 因此，用大腸桿菌 GJ100 作為宿主時(shí)，表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控方式為貧氧 誘導(dǎo)型， 菌體發(fā)酵時(shí)的溶氧濃度可以通過(guò)控制攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量 加以調(diào)節(jié)，與其他調(diào)控模式相比更適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程。 生物素調(diào)控型 用大腸桿菌 生物素操縱子 及其調(diào)控區(qū)構(gòu)建表達(dá)載體 ， 菌體生長(zhǎng)過(guò)程 中生物素會(huì)不斷消耗 ， 當(dāng)濃度到達(dá) 2ng/ml 以下時(shí)啟動(dòng)子被激活 。 其他表達(dá)系統(tǒng) 第三十三頁(yè)，共八十七頁(yè)。 強(qiáng)終止子的選擇與使用 目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來(lái)自大腸桿菌 rRNA 操縱子上 的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌體 DNA 上的 Tf。 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻 率，而且在很大程度上還與 mRNA 的翻譯起始效率密切相關(guān)。 mRNA 翻譯的起始效率主要由其 5‘ 端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)〔 RBS〕 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 第三十六頁(yè)，共八十七頁(yè)。 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括以下四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素： 位于翻譯起始密碼子上游的 6–8 個(gè)核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’ 即 ShineDalgarno〔 SD〕序列，它通過(guò)識(shí)別大腸桿菌核糖體小亞 基中的 16S rRNA 3’ 端區(qū)域 3’ AUUCCUCC 5’ 并與之專一性結(jié)合 將 mRNA 定位于核糖體上，從而啟動(dòng)翻譯； 翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大局部基因以 AUG作為閱讀框架的 起始位點(diǎn)，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作為翻譯起始密碼子 SD 序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成 基因編碼區(qū) 5’ 端假設(shè)干密碼子的堿基序列 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 第三十八頁(yè)，共八十七頁(yè)。 對(duì)多數(shù)基因而言，上述四個(gè)堿基中任何一個(gè)換成 C 或 T，均會(huì)導(dǎo) 致翻譯效率大幅度降低 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 第三十九頁(yè)，共八十七頁(yè)。 緊鄰 AUG 的前三個(gè)堿基成份對(duì)翻譯起始也有影響 。 核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響 SD 序列與起始密碼子之間的距離的影響 SD 序列與起始密碼子 AUG 之間的精確距離保證了 mRNA 在 核糖體上定位后 ， 翻譯起始密碼子 AUG 正好處于核糖體復(fù)合物 結(jié)構(gòu)中的 P 位 ， 這是翻譯啟動(dòng)的前提條件 。 核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響 起始密碼子及其后續(xù)假設(shè)干密碼子的影響 大腸桿菌中的起始 tRNA 分子可以同時(shí)識(shí)別 AUG、 GUG 和 UUG 三種起始密碼子 ， 但其識(shí)別頻率并不相同 ， 通常 GUG 為 AUG 的 50%， 而 UUG 只及 AUG 的 25%。 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 第四十二頁(yè)，共八十七頁(yè)。 密碼子 密碼子偏愛(ài)性對(duì)外源基因表達(dá)的影響 由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動(dòng)物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個(gè)重要因素是密碼子的正確選擇。 質(zhì)?？截悢?shù) 質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的影響 目前實(shí)驗(yàn)室里廣泛使用的表達(dá)型質(zhì)粒在每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個(gè)拷貝 ，質(zhì)粒的擴(kuò)增 過(guò)程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi) ， 而此時(shí)正是 細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段 。 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) 蛋白質(zhì)的合成是在細(xì)胞之中進(jìn)行的 目標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的主要優(yōu)點(diǎn)是： 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建比較簡(jiǎn)單； 能夠到達(dá)很高的目標(biāo)蛋白表達(dá)量，一般可以到達(dá)占細(xì)胞總蛋白的 20%～ 40%。 第四十六頁(yè)，共八十七頁(yè)。 包涵體及其性質(zhì) 在某些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體〔 Inclusion Bodies， IB〕。 由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。 以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn) 包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn) 在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 能夠防止細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標(biāo)蛋白的富集 簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的別離操作 包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌 體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過(guò)高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)