【正文】 蛋白。 目標蛋白在周質空間中表達 目標蛋白在周質空間中表達的優(yōu)點 ⑴ 大腸桿菌周質空間中自身蛋白質的數(shù)量約為 100 種，只占菌體總蛋白數(shù)量的 4%。 第五十九頁，共八十七頁。 四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術 表達質粒的優(yōu)化和設計 共表達大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因 提高目標基因 mRNA 和目標基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性 高密度發(fā)酵和工程化宿主細胞 第六十一頁，共八十七頁。 第六十二頁，共八十七頁。 核糖體結合位點序列的變化對 mRNA 的翻譯效率有顯著影響，具體表現(xiàn)為： SD 序列 UAAGGAGG 的翻譯效率要比 AAGGA 高 3～ 6倍 翻譯起始密碼 ATG 與 UAAGGAGG的最適距離是 6～ 8 個堿基長度， 與 AAGAA 的最適距離是 5～ 7 個堿基長度 ATG 與 UAAGGAGG 至少相隔 3 ～ 4個堿基，與 AAGAA 至少相隔 5 個堿基； mRNA 的翻譯才能進行 ATG 與 SD 序列之間的堿基組成為 A， T 堿基豐富時， mRNA 翻譯效 率較高。 在必要的情況下 ， 還可通過定點突變 ， PCR 等技術改變個別關鍵的堿基來破壞 mRNA 5’ 端的 “ 莖環(huán) 〞 結構 。 四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術 第六十七頁，共八十七頁。 共表達大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因 由于同義密碼子的使用頻率與細胞內對應的 tRNA 的豐度有正比關系稀有密碼子對應的 tRNA 的豐度很低 ， 有可能在翻譯過程中發(fā)生中止和移碼突變 。 人尿激酶原 ProUK， 新型組織纖溶酶原激活劑 NTA 等基因中都含有較多的 AGG 和 AGA 密碼子 ， 在大腸桿菌中直接表達的水平很低 ， 但在大腸桿菌中共表達 tRNA Arg(AGG/AGA) 基因 argU 后 ， 這些基因的表達水平能明顯得到提高 。 四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術 第七十頁，共八十七頁。 通過對能看出大腸桿菌細胞內半衰期的蛋臼質的統(tǒng)計學分析 ， 發(fā)現(xiàn) N末 端為 Arg 、 Lys 、 Leu 、 Phe 、 Tyr 、 Trp 殘基的蛋白質 ， 含有 Pro Glu 、 Ser 、 Thr 豐富區(qū)的蛋白質容易降解 ， 穩(wěn)定性較差 。 對分子量較小的目標基因進行融合表達或串聯(lián)聚合表達 。 四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術 第七十三頁，共八十七頁。 融合表達使目標蛋白的構象與天然狀態(tài)不一樣 ， 導致生物比活力降低 ， 甚至沒有活性 。 對蛋白質序列進行改造需要有根本的蛋白質結構數(shù)據(jù) ， 而目前這方面的數(shù)據(jù)庫還不完整 。 目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種 第七十五頁，共八十七頁。 但從實際應用上看 ， 這些措施都有一定的滯后效應 ， 難以做到比較精確的控制 。 從而降低菌體產(chǎn)生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值 。 構建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 對于以可溶性或分泌形式表達的目標蛋日而言 ， 隨著發(fā)酵后期各種蛋白水解酶的累積 ， 目標蛋白會遭到蛋白水解酶的作用而被降解 。 到目前為止 ， 能看出的大腸桿菌蛋白水解酶基因缺陷的突變株都巳被獲得 ， 其中一局部具有實際應用的潛力 。 共表達與蛋白質折疊過程密切相關的分子伴侶 包涵體是由于在新合成的大量目標蛋白質的折疊過程中，大腸桿菌細胞內參與折疊的蛋白因子的量不能滿足需要，無法形成正確的構象而產(chǎn)生的，因此在大腸桿菌內共表達與蛋白質折疊過程密切相關的分子伴侶，折疊酶或硫氧還蛋白基因可以使目標基因可溶性表達的比例明顯上升。 共表達人或小鼠的二硫鍵異構酶、促進二硫鍵形成和正確折疊 大腸桿菌周質空間通過二硫鍵形成酶 DsbA 和 DsbB 二個蛋白維持適 當?shù)难趸瘡驮瓚B(tài)勢使蛋白質的二硫鍵形成。 五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的開展趨勢 第八十一頁，共八十七頁。 改造信號肽的序列和結構，提高分泌效率 改造信號肽的序列和結構，提高分泌效率 比較成功的例子是發(fā)現(xiàn)了把堿性磷酸酯酶基因 phoA 信號肽的疏水區(qū) 置換為多聚 Leu 殘基能明顯提高分泌效率。 大腸桿菌外表表達技術的建立 膜蛋白基因在大腸桿菌中表達的技術逐漸成為研究的熱點領域 ，膜蛋 白表達技術的開展促進了大腸桿菌外表表達技術的建立 。 大腸桿菌外表表達技術的建立 主 要 通 過 三 條 途 徑 使 目 標 蛋 白 呈 現(xiàn) 在 菌 體 外 表 : 把外源序列插入 LamB 、 OmpA、 PhoE 等外膜蛋白的膜外區(qū) 把外源蛋白導入大腸桿菌鞭毛或傘毛的結構中 這二種方法適合表達一段長度小于 100 個氨基酸殘基的外源序列 ， 因為較大的外源序列的插入往往會使外膜蛋白不能形成原來的三維 結構 ， 影響它轉運過程和在膜上的定位 。其中需要研究的主要問題有 : 如何使肽酰甘氨酸酰胺化酶在大腸仟菌內有較高的活力和專一性 。菌體啟動子控制的基因的轉錄到達很高的水平。采用較弱的啟動子或局部誘導強啟動子的方法可降低蛋白質合成的速 第八十七頁，共八十七頁。這是因為大腸桿菌細胞質微環(huán)境的氧化復原態(tài)勢不利于蛋白質二硫鍵的形成，而且缺少一種形成二硫鍵所必須的體系。 五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的開展趨勢 第八十六頁，共八十七頁。 五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的開展趨勢 第八十五頁，共八十七頁。 在一定程度上能與噬菌體展示系 統(tǒng)相媲美 。這一結果為天然信號肽優(yōu)化 改造的設計提供了很好的參考依據(jù)。 采用較弱的啟動子或局部誘導強啟動子的方法可降低蛋白質合成的速 率 ， 從而到達增加正確折疊重組蛋白質的目的 。 PDl 對目標蛋白的二硫鍵形成和正確折疊的促進作用可以受到谷 胱甘肽的調節(jié)。在有些情況下需要有多個蛋白因子共表達才能到達預期的目標。 五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的開展趨勢 構建各種表達載體 建立新的表達系統(tǒng) 目前研究的重點完善現(xiàn)有的表達系統(tǒng)，解決表達系統(tǒng)中還存在的缺陷 等方面。 rpoH 基因編碼大腸桿菌 RNA 聚合酶的 r32 亞基 ， r32 亞基對大腸桿菌中多種蛋白水解酶的活力有正調控作用 。 改變代謝流的方向 ， 通過共轉化把枯草桿菌 、 釀酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因 alsS， 單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因 pdc1 和乙醇脫氫酶基因 adh2 導入大腸桿菌 ， 使丙酮酸的代謝有選擇地向生成 3‘ 羥基丁酮或乙醇的方向進行 。 四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術 第七十六頁，共八十七頁。 這是高密度發(fā)酵工藝研究中最迫切需要解決的問題 。 四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術 高密度發(fā)酵和工程化宿主細胞 大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質過程中不可缺少的工藝步驟。 酶法本錢比較高且參加的酶蛋白還必須別離去除 。 主要表現(xiàn)為： 大腸桿菌對分子量較大的目標蛋白的較運和分泌效率一般比較低 ， 不能滿足大規(guī)饃制備的需要 。 對蛋白質序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識別位點進行改造 。 四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術 第七十二頁，共八十七頁。 四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術 第七十一頁，共八十七頁。 因為稀有密碼子存在的位置 、 分布的均勻性 、 mRNA 的二級結構的不同決定了它對翻譯過程的影響是有差異的 。 在表達系統(tǒng)中共表達稀有密碼子 tRNA 基因 ， 以提高大腸桿菌細胞 內稀有密碼子 tRNA 的豐度 四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術 第六十九頁，共八十七頁。 現(xiàn)已說明的在大腸桿菌中的稀有密碼子有： 編碼 Arg 的密碼子 AGA、 AGG、 CGA、 CGG 編碼 Pro 的密碼子 CCC、 CCU、 CCA 編碼 Cys 的密碼子 UGU、 UGC。 這一方法通常適用于目標基因 5’ 端序列容易形成二級結構 ， 而又不宜改變其序列的情形下 第六十六頁，共八十七頁。 核糖體結合位點本身和附近的序列決定了目標基因 mRNA 5’ 端的二級結構 ， 研究說明討 mRNA 5’ 端形成的 “ 莖環(huán) 〞 結構阻礙了 mRNA 與核糖體 30S 亞基的結合 ， 從而抑制了翻譯的起始 。 第六十四頁，共八十七頁。這一插入位點附近的序列將成為核糖體結合位點的一局部，因此它對于構建高效表達質粒是至關重要的。 目前成功的例子主要是采用以下方案 : 〔 1〕 與大腸桿菌本身的外泌蛋白基因融合表達 〔 2〕 與一些能提高細胞外膜通透性的因子融合或共表達 〔 3〕 改變培養(yǎng)基的成分 歸納現(xiàn)有的研究結果顯示這些方法僅對外泌分子量較小的蛋白有效 ， 而且外泌效率一般都比較低 。 ⑵ 目標蛋白從細胞質轉運到周質空間過程中信號肽被加工切除，有效地防止了 N 端附加的甲硫氨酸的產(chǎn)生。 第五十七頁，共八十七頁。 第五十六頁，共八十七頁。 第五十五頁，共八十七頁。 在細胞質中直接表達不帶有前導序列的成熟蛋白質 在細胞質中直接表達不帶有前導序列的成熟蛋白質需要起始密碼 ， 通常為編碼甲硫氨酸的 ATG。 研究說明 trxB 缺陷株細胞質的氧化復原態(tài)勢發(fā)生了變化 ， 蛋白質在 trxB 缺陷株的細胞質中能夠形成二硫鍵 。 分泌型異源蛋白的表達 第五十三頁，共八十七頁。 能有效促進包涵體溶解變性的試劑和條件包括： 清 洗 劑 SDS、正十二醇肌氨酸，廉價， 但影響復性和純化 促 溶 劑 鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素廉價， 但常被自發(fā) 形成的氰酸鹽污染， 后者能與多肽鏈中的氨基反響 混合溶劑 如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用， 溶解力增強 極 端 pH 廉價，但許多蛋白質在極端 pH條件下發(fā)生修飾反響 包涵體型異源蛋白的表達 第五十一頁，共八十七頁。