廣西地方標(biāo)準(zhǔn)豬藍(lán)耳病病毒美洲型野毒株和疫苗株的鑒別檢測(cè)多重?zé)晒舛糠崔D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法征求意見(jiàn)稿-wenkub
2022-09-17 18:44:49 本頁(yè)面
【正文】 1豬藍(lán)耳病病毒美洲型野毒株和疫苗株的鑒別檢測(cè) 多重?zé)晒舛糠崔D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用于鑒別檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型野毒株及疫苗株的多重?zé)晒舛糠崔D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法的材料準(zhǔn)備、操作方法及結(jié)果判定。 豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型經(jīng)典株 classical porcine reproductive and respiratory syndrome virus，CPRRSV指在病毒 Nsp2 蛋白第 481 位和第 533?561 位氨基酸未出現(xiàn)缺失的、以 VR2332 毒株為代表的美洲基因型豬繁殖與呼吸綜合征病毒。該疫苗株除了在Nsp2 蛋白存在 481位氨基酸 和 533?561位氨基酸 共 30 個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失外，在628?747位氨基酸還出現(xiàn)120 個(gè)氨基酸的整段缺失。指在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物及多條標(biāo)有不同熒光基團(tuán)的探針，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)模板并利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè) PCR 進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。 RNA 抽提試劑盒商業(yè)化的 RNA?抽提試劑盒主要成分見(jiàn)附錄?B 中的 ，使用前經(jīng)技術(shù)驗(yàn)證合格。 一次性耗材一次性耗材包括：a）乳膠手套；b）離心管；c）PCR 反應(yīng)管；d）吸頭；e）熒光 PCR 反應(yīng)管?！〈龣z樣品處理采取病豬的肺臟、脾臟和淋巴結(jié)等組織共約 1 g，置于 mL 離心管中，加入滅菌的 1 mol/L PBS（pH ）1 mL，用組織勻漿機(jī)充分研磨后，反復(fù)凍融 3 次；細(xì)胞培養(yǎng)物則直接反復(fù)凍融 3 次。L 待檢樣品于無(wú) RNA 酶的 mL 離心管中，按照 RNA 提取試劑盒操作說(shuō)明書抽提總 RNA 。L；b）AMV?反轉(zhuǎn)錄酶（5 U/181。L）：?181。L； g）待檢總 RNA 模板：4 181。將?PCR?反應(yīng)管置于普通 PCR 儀內(nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。L。L）：各 181。L）： 181。L）：1 181。加完試劑后瞬時(shí)離心混勻。病毒細(xì)胞培養(yǎng)物的處理、?！￡幮詫?duì)照用 滅菌雙蒸水代替模板作為陰性對(duì)照模板。反之，此次檢測(cè)無(wú)效。注：PRRSV?多重?zé)晒舛縍TPCR結(jié)果曲線圖見(jiàn)附錄 A?中的圖 。擴(kuò)增CPRRSV代表毒株VR2332株（GenBank 登錄號(hào)：AY150564）Nsp2基因目的片段的核苷酸序列如下：GAGTGAGCCGGCTCCAATTCCCGCACCTCGCGGAACTGTGTCTCGACCGGTGACACCCTTGAGTGAGCCGATCCCTGTGCCCGCACCGCGGCGTAAGTTTCAGCAGGTGAAAAGATTGAGTTCGGCGGCGGCAATCCCACCGTACCAGGACGAGCCCCTGGATTTGTCTGCTTCCTCACAGACTGAATATGAGGC 擴(kuò)增的HPPRRSV Nsp2基因目的片段擴(kuò)增HPPRRSV Nsp2基因中108 bp 的片段。1 HPPRRSV（+）；2 CPRRSV（+）；3 VPRRSV（+）；4 陰性對(duì)照?！∩虡I(yè)化的 RTPCR 試劑盒主要成分包括：a）10?RT 緩沖液；b）AMV 反轉(zhuǎn)錄酶；c）dNTP?混合物：包含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP；d）RNA?酶抑制劑；e）MgCl 2 溶液；f）隨機(jī)引物?9?聚體；g）5 RT buffer；DB45/T XXXXX—XXXX9h）Ex Taq HS 聚合酶。DB45/T XXXXX—XXXX10B B附 錄 C（規(guī)范性附錄）重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備 特異性引物。在冰浴條件下，在 PCR 反應(yīng)管中按下列用量分別加入各成分：a）5 RT buffer:10 μL； b）Ex Taq HS 聚合酶（5 U/μL）： 181。L?！≈亟M質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳、用凝膠成像系統(tǒng)觀察后，按膠回收試劑盒說(shuō)明書回收、純化PCR產(chǎn)物?！≈亟M質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品鑒定 PCR鑒定以提取的質(zhì)粒為模板，、凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察。_________________________________。 測(cè)序鑒定對(duì)獲得的質(zhì)粒送商業(yè)測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，并將獲得的序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)所獲得的序列與標(biāo)準(zhǔn)毒株相應(yīng)區(qū)域的序列一致。挑選陽(yáng)性菌落，増菌培養(yǎng)后，按質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒。將 PCR 反應(yīng)管置于 PCR 儀內(nèi)，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；然后94
黨政相關(guān)相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1