廣西地方標準豬藍耳病病毒美洲型野毒株和疫苗株的鑒別檢測多重熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法征求意見稿-wenkub
2022-09-17 18:44:49 本頁面
【正文】 1豬藍耳病病毒美洲型野毒株和疫苗株的鑒別檢測 多重熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法1 范圍本標準規(guī)定了用于鑒別檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型野毒株及疫苗株的多重熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法的材料準備、操作方法及結(jié)果判定?！∝i繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型經(jīng)典株 classical porcine reproductive and respiratory syndrome virus，CPRRSV指在病毒 Nsp2 蛋白第 481 位和第 533?561 位氨基酸未出現(xiàn)缺失的、以 VR2332 毒株為代表的美洲基因型豬繁殖與呼吸綜合征病毒。該疫苗株除了在Nsp2 蛋白存在 481位氨基酸 和 533?561位氨基酸 共 30 個氨基酸的不連續(xù)缺失外，在628?747位氨基酸還出現(xiàn)120 個氨基酸的整段缺失。指在同一反應(yīng)體系中加入多對引物及多條標有不同熒光基團的探針，同時擴增多個模板并利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個 PCR 進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法?！NA 抽提試劑盒商業(yè)化的 RNA?抽提試劑盒主要成分見附錄?B 中的 ，使用前經(jīng)技術(shù)驗證合格。 一次性耗材一次性耗材包括：a）乳膠手套；b）離心管；c）PCR 反應(yīng)管；d）吸頭；e）熒光 PCR 反應(yīng)管?！〈龣z樣品處理采取病豬的肺臟、脾臟和淋巴結(jié)等組織共約 1 g，置于 mL 離心管中，加入滅菌的 1 mol/L PBS（pH ）1 mL，用組織勻漿機充分研磨后，反復(fù)凍融 3 次；細胞培養(yǎng)物則直接反復(fù)凍融 3 次。L 待檢樣品于無 RNA 酶的 mL 離心管中，按照 RNA 提取試劑盒操作說明書抽提總 RNA 。L；b）AMV?反轉(zhuǎn)錄酶（5 U/181。L）：?181。L； g）待檢總 RNA 模板：4 181。將?PCR?反應(yīng)管置于普通 PCR 儀內(nèi)進行反轉(zhuǎn)錄。L。L）：各 181。L）： 181。L）：1 181。加完試劑后瞬時離心混勻。病毒細胞培養(yǎng)物的處理、。 陰性對照用 滅菌雙蒸水代替模板作為陰性對照模板。反之，此次檢測無效。注：PRRSV?多重熒光定量RTPCR結(jié)果曲線圖見附錄 A?中的圖 。擴增CPRRSV代表毒株VR2332株（GenBank 登錄號：AY150564）Nsp2基因目的片段的核苷酸序列如下：GAGTGAGCCGGCTCCAATTCCCGCACCTCGCGGAACTGTGTCTCGACCGGTGACACCCTTGAGTGAGCCGATCCCTGTGCCCGCACCGCGGCGTAAGTTTCAGCAGGTGAAAAGATTGAGTTCGGCGGCGGCAATCCCACCGTACCAGGACGAGCCCCTGGATTTGTCTGCTTCCTCACAGACTGAATATGAGGC 擴增的HPPRRSV Nsp2基因目的片段擴增HPPRRSV Nsp2基因中108 bp 的片段。1 HPPRRSV（+）；2 CPRRSV（+）；3 VPRRSV（+）；4 陰性對照?！∩虡I(yè)化的 RTPCR 試劑盒主要成分包括：a）10?RT 緩沖液；b）AMV 反轉(zhuǎn)錄酶；c）dNTP?混合物：包含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP；d）RNA?酶抑制劑；e）MgCl 2 溶液；f）隨機引物?9?聚體；g）5 RT buffer；DB45/T XXXXX—XXXX9h）Ex Taq HS 聚合酶。DB45/T XXXXX—XXXX10B B附 錄 C（規(guī)范性附錄）重組質(zhì)粒標準品制備 特異性引物。在冰浴條件下，在 PCR 反應(yīng)管中按下列用量分別加入各成分：a）5 RT buffer:10 μL； b）Ex Taq HS 聚合酶（5 U/μL）： 181。L?！≈亟M質(zhì)粒標準品構(gòu)建將PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳、用凝膠成像系統(tǒng)觀察后，按膠回收試劑盒說明書回收、純化PCR產(chǎn)物?！≈亟M質(zhì)粒標準品鑒定 PCR鑒定以提取的質(zhì)粒為模板，、凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察。_________________________________。 測序鑒定對獲得的質(zhì)粒送商業(yè)測序公司進行測序，并將獲得的序列在NCBI上進行比對，確認所獲得的序列與標準毒株相應(yīng)區(qū)域的序列一致。挑選陽性菌落，増菌培養(yǎng)后，按質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒。將 PCR 反應(yīng)管置于 PCR 儀內(nèi)，反應(yīng)程序為：94 ℃ 2 min；然后94
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