【正文】 凝集，可見傷寒免疫血清與兩種菌均有凝集，說明二菌具有共同抗原結構，故發(fā)生交叉凝集反應。利用凝集吸收試驗可制備單價因子血清，以進行細菌抗原結構的分析及鑒定菌型。三．凝集吸收腸道桿菌中的許多細菌都有部分相同的抗原結構。3．協(xié)同凝集試驗?取傷寒“O”可溶性抗原一滴致敏葡萄球菌懸液，一滴在載波片上混勻，觀察約2分鐘。置于80℃水浴中4分鐘以破壞菌體的自源性分解酶。（三） 協(xié)同凝集試驗金黃色葡萄球菌細胞壁成分中的A蛋白能與人及多種哺乳動物（豬、兔、羊、鼠等）血清中IgG類抗體 的Fc段結合。3．滴加一滴膠乳抗原，緩慢搖動3—5分鐘，在較強光線下，觀察結果。反之，被檢尿中絨毛膜促性腺激素含量甚少（非妊娠尿）不足以把加入的抗體消耗，當膠乳抗原加入后，抗體便與抗原結合發(fā)生反應。（二） 間接凝集抑制試驗若使可溶性抗原與相應抗體先混合，充分作用后再加入有關的免疫微球，因抗體已被可溶性抗原結合，不再出現(xiàn)免疫微球的被動凝集現(xiàn)象，叫間接凝集抑制試驗，臨床化驗檢查中常用的免疫妊娠試驗就是一種間接凝集抑制試驗。如此依次稀釋直至第8管。然后取出，用生理鹽水洗滌3次，%懸液即成。間接血凝抗原的制備可用加堿或加熱的方法使菌體中的多糖物質浸出，去除類脂以免干擾紅血球的吸附作用。間接凝集反應比直接凝集反應敏感性為高，可用于微量抗體或抗原的檢查。如血清的最低稀釋度（即第1管1：40）仍無凝集應報告為低于1：40?！癏”菌液的凝集塊疏松呈棉狀，大片沉于管底輕搖即升起，并極易破碎。但如放置時間較長，細菌堆于管底成小圓點狀，為陰性反應。5．。此時，自第1管至第6管的血清稀釋倍數(shù)為1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640。3．生理鹽水，小試管，吸管。如結果不夠清晰，可將玻片放于低倍顯微鏡下觀察。2．無菌操作下，用接種環(huán)取傷寒桿菌培養(yǎng)物少許，混于第三格中，再混于第一格中（不能先混第一格再混第三格，因為這樣將使診斷血清混入鹽水而影響對照結果），將細菌與鹽水或血清混合均勻使呈乳狀液。即可用已知免疫血清來檢查未知抗原，亦可用已知抗原檢測特異性抗體。5．取下瓊脂板，以抗原孔中心為起點，量出各火箭狀沉淀線的高度。其原理為：在電場作用下，抗原在含定量抗體的瓊脂介質中泳動，二者比例在合適時在較短時間內形成狀似火箭或錐形的沉淀線，而此沉淀線的高度常與抗原量成正比關系，因此本法可以測定樣品中抗原的含量。：電壓9—7伏/厘米，泳動15—20小時。3．%離子瓊脂（系用巴比妥緩沖液配制的）4．電泳儀5．巴比妥緩沖液：蒸餾水1000毫升，離子強度（M）6．其它：載物玻片，直徑3毫米打孔器，20mmⅹ2mm玻璃鑄型，微量進樣器。使抗原抗體進行雙向擴散，在比例適宜部位形成特異的抗原抗體沉淀弧線。（3） 電壓與電流時電泳時間需要長些：電壓電流增大時，電泳時間可更短。隨稀釋度的增加，抗原抗體的比例發(fā)生變化，沉淀線由靠近抗血清孔向逐步移向兩孔中間，并可出現(xiàn)不典型的沉淀線如弧形、八字須形、斜線形，這些也是陽性，應予注意。4．結果觀察：在黑色背景上方，用散射光多個角度觀察，在對孔之間有白色沉淀線即為陽性對照應出現(xiàn)明顯的白色沉淀線。以板寬度計算電流，以板的長度計算電壓。2．加樣：左側孔內加患者血清（原血清及10倍稀釋血清各占一孔），右側內加抗血清，每片應有陽性對照。 材料：1．診斷血清：免抗人免疫血清2．待檢血清：人血清3．陰性對照血清4．, 巴比妥鈉 巴比妥 蒸餾水 1000毫升5．緩沖瓊脂板：（）%的瓊脂，%流柳汞防腐，保存冰箱內備用。瓊脂是一種酸性物質，在堿性緩沖液中進行電泳，它帶有負電荷，而與瓊脂相接觸的水溶液就帶正電荷，這樣的液體便向負極移動。但由于抗體分子在這樣的PH條件下只帶微弱的負電荷，而且它的分子量又較大（為r球蛋白）。玻片法可在12小時出現(xiàn)，一般觀察72小時，放量過久可出現(xiàn)沉淀線重合消失。④瓊脂濃度對沉淀線形成速度的影響：一般來說，瓊脂濃度越大，沉淀線出現(xiàn)越慢。見圖4。①抗原特異性與沉淀線形狀的關系：在相鄰兩完全相同的抗原與抗體反應時，則可出現(xiàn)兩單沉淀線的融合。若在72小時仍未出現(xiàn)沉淀線則為陰性反應。圖2 雙向瓊脂擴散原抗體孔位置示意圖3．用微量進樣器于中央孔加抗體，于周圍孔加各種抗原。（2） 雙向瓊脂擴散試驗材料：1．診斷血清：兔抗人血清2．待測血清：人血清3．陰性對照血清4．其它：生理鹽水、瓊脂粉、載玻片、打孔器、微量進樣器等。2．在免疫瓊脂板上按一定距離（—）打孔，見圖1。瓊脂擴散試驗可根據(jù)抗原抗體反應的方式和特性分為單向免疫擴散、雙向免疫擴散、免疫電泳、對流免疫電泳、單向及雙向火箭電泳試驗。（二）.瓊脂擴散試驗瓊脂擴散是抗原抗體在凝膠中所呈現(xiàn)的一種沉淀反應。方法：1. 取小沉淀管2只，加入第一管，加時注意不能有氣泡。沉淀反應的種類有環(huán)狀沉淀、絮狀沉淀、莢膜膨脹、瓊脂擴散及免疫電泳等。經5分鐘后，用蒸餾水洗凈，待干后用油鏡檢查。（配置時，要先將瑞特氏染料置研缽體內邊研邊滴加甲醇，使染料溶液得更好。四．巨噬細胞：又稱組織細胞，細胞形態(tài)不規(guī)則。三．漿細胞的觀察（示教）細胞呈圓形或卵圓形，胞質豐富，呈嗜鹼性。直徑1420微米。68微米。小淋巴細胞與紅血球大小相似，圓形。直徑10—15微米。實驗器材：顯微鏡血液涂片（瑞氏染色）結締組織切片方法：油鏡觀察一．血涂片的觀察（A） 紅細胞：淡紅色，無核的圓形細胞，因紅血球為雙凹形，故邊緣部分染色較深，中心較淺，直徑7—8微米。（B） 顆粒白血球嗜中性顆粒白血球：體積略大于紅細胞，細胞核被染成紫色分葉狀，可分1—5葉，核葉之間聯(lián)以染色質細絲，染色質染成粉色，其中充滿細小的大小均勻的顆粒被染成紫紅色。嗜堿性顆粒白血球：體積略小于嗜酸性白血球，細胞質中有大小不等被染成紫色顆粒，顆粒數(shù)目較嗜酸性白血球的顆粒少，核為1—2葉染成淡蘭色。其中含致密的核，染成深紫色。單核細胞：體積最大，細胞圓形。二．肥大細胞的觀察（示教）胞體較大，呈卵圓形，胞質內充滿粗大均等的嗜鹼性顆粒。核圓形，著色深，多偏于細胞的一側，染色質核膜呈車輪分布。常伸出短而鈍突起，有很強的吞噬能力。）2．瑞特氏染色法：取小鼠骨動脈血，涂制玻片。 實驗二 沉淀反應可溶性抗原與相應的抗體混合，在電解質存在的條件下，兩者比例適合，即可有沉淀物出現(xiàn)，叫沉淀反應（Precipitation）.由于沉淀反應抗原多系膠體溶液。此外還有放射性同位素標記、酶標記等測定法。2. ?？贵w在含有電解質的瓊脂凝膠中相遇時，便出現(xiàn)可見的白色沉淀線。（1） 單向瓊脂擴散試驗材料：1．診斷血清（抗體：抗人IgG或IgA免疫血清）2．待檢血清（抗原）：人血清3．參考血清：全國統(tǒng)一人血清免疫球蛋白參考血清（批號不同，免疫球蛋白含量不同）。圖1單向瓊脂擴散試驗抗原孔位置示意圖15孔加參考血清，67孔加待檢血清3．向孔內滴加1：2，1：4，1：8，1：16，1：32稀釋的參考血清及1：10稀釋的待檢血清，每孔10微升，此時加入的抗原液面應與瓊脂板一平，不得外溢。方法：1．取一清潔載玻片，—%食鹽瓊脂制成瓊脂板。加樣時勿使樣品外溢或在邊緣殘存小氣泡，以免影響擴散結果。實驗時至少要做一陽性對照。反之，如相鄰抗原完全不同時，則出現(xiàn)沉淀線之交叉；兩種抗原部分相同時，則出現(xiàn)沉淀線的部分融合。 圖4 抗原特異性與沉淀線形狀的關系 a、b：抗體 A、A’、B：抗原 A、B完全不同 A、A’部分相同 ③溫度對沉淀線的影響：在一定范圍內，溫度擴散快。⑤參加擴散的抗原與抗體間的距離對沉淀線形成的影響：抗原、抗體相距越遠，沉淀線形成的越慢，所以在微量玻片法時，距離遠影響反應速度。（三）對流免疫電泳試驗 對流免疫電泳是在瓊脂擴散基礎上結合電泳技術而建立的一種簡便而快速的方法。所以游動慢?？贵w分子就是隨著帶正電荷的液體向負極移動的。6．電泳儀7．其他：生理鹽水、打孔器、微量進樣器。圖5 對流免疫電泳抗原孔、抗體孔位置示意圖3．電泳用國產普通電泳儀。要求電流量為2—3毫安/厘米，即大板為20毫安，小板為10毫安。如果抗原，兩極微沉淀條紋不清晰，于37℃保溫數(shù)小時可增強沉淀條紋的清晰度。（2） 幾組電泳緩沖液其電泳結果以巴比妥鈉—鹽酸緩沖液靈敏度最高。但電壓過高則孔徑變形，電流過大抗原抗體蛋白易變性，干擾實驗結果。每條沉淀弧線代表一組抗原抗體復合物，故可用抗原成分分析；且可以根據(jù)其遷移率與抗體所出現(xiàn)的特異反應進行鑒定。方法：（ⅹ）%瓊脂凝膠，制成2毫米厚的瓊脂板。，加入抗血清，進行雙擴散，一般在24小時內沉淀弧出全。材料：1．診斷血清（抗體）：抗人IgG或IgA免疫血清2．待檢血清（抗原）：人血清3．參考血清4．，（見對流免疫電泳試驗）5．其它：瓊脂粉，微量進樣器，打孔器，玻璃板，電泳儀方法：1．抗體瓊脂板的制備同單向擴散法。同單向瓊脂擴散法繪制標準曲線，查出待檢血清中Ig含量。一．直接凝集反應顆?？乖c抗體直接結合出現(xiàn)凝集現(xiàn)象叫直接凝集反應。此時取菌量不可過多，使懸液呈輕度乳濁即可。（二） 試管凝集反應 為一種定量試驗，用已知抗原檢查血清中有無特異抗體，并測定其相對含量。方法：1．取潔凈小試管14只分兩排排列于試管架上，每排7只依次用蠟筆注明號碼。第7管不加血清作為對照。6．將各管振蕩混勻，放37℃水浴箱中2—4小時或37℃孵育箱中過夜次日取出觀察結果。3．試驗管應自第1管看起，如有凝集時則于管底有不同大小的圓片狀邊緣不整齊的凝集物，上清則澄清透明或不同程度混濁。“O”菌液凝集呈緊密顆粒狀，沉于管底堅實致密，輕輕振搖不易升起，凝集顆粒較小不易搖碎。如血清的最高稀釋度（即第6管1：1280）仍顯完全凝集現(xiàn)象。（一） 間接血球凝集試驗間接血球凝集試驗是根據(jù)紅血球表面的吸附作用而建立起來的。但如系蛋白質時則用來吸附的紅血球需先用鞣酸予以處理。3．試驗步驟：（1）小試管9只標好號碼于試管架上。第9管不加血清作對照。妊娠試驗：孕婦尿中絨毛膜促性腺激素的含量比正常尿高。出現(xiàn)均勻細小顆粒，妊娠試驗為陰性。出現(xiàn)均勻一致的細小顆粒為陰性反應，懷孕。IgG的Fe段與SpA結合后，兩個Fab段暴露在葡萄球體表面，仍保持其抗體活性和特異性當其與特異性抗原相遇時，也出現(xiàn)特異凝集現(xiàn)象。再用PBS洗滌2次后配成10%菌懸液。一般在幾秒鐘內即可發(fā)生凝集。因之一種細菌可與另一種細菌相應的抗血清發(fā)生交叉凝集反應。材料：1. 免疫血清：1：10稀釋傷寒桿菌免疫血清。2. 將一定量的腸炎桿菌菌液加入1：10稀釋傷寒桿菌免疫血清中，放37℃水浴箱中作用2小時，取出后離心沉淀，吸取上清夜，棄去沉淀。如與前者無凝集而與后者有凝集，則表示傷寒桿菌免疫血清中的抗腸炎抗體已被完全吸收。應用溶血反應是補體結合反應中不可少的因素。4. 小試管、生理鹽水、水浴箱。本反應具有很高的敏感性及特異性，因之常應用于傳染病的診斷，特別診斷病毒疾病和梅毒。方法：（一） 預備試驗（示教說明）預備試驗包括溶血素效價的滴定，補體效價的滴定，抗原效價的滴定及被檢血清的處理。上表的結果為：補體標準單位：補體實用單位：補體兩個實用單位：，可依下列比例關系換算：20：=ⅹ：ⅹ= 。若有抗補體發(fā)生，應抽血重試驗。材料及試劑：a) 新鮮豚鼠血b) 兔紅細胞（RRBC）c) 溴花二氨基異硫氫化物（AET）d) 淋巴細胞分層液e) 其它Hanks液，含小牛血清的199培養(yǎng)液，無菌生理鹽水，%氯化鈉溶液，離心機等。取出加冷無菌生理鹽水至離心管口（1—2厘米）1800轉/分離心5分鐘。2. 從新鮮豚鼠血液分離單個核細胞，操作見后試驗。實驗六 豚鼠T淋巴細胞的測定——兔紅細胞玫瑰花環(huán)試驗玫瑰花環(huán)試驗，又稱為花結試驗。根據(jù)E—玫瑰花環(huán)形成率，可以間接判斷機體細胞免疫力。方法：1. 淋巴細胞提?。?） 取豚鼠抗凝血2毫升，加3毫升Hanks液使之稀釋?；旌虾螅?7℃水浴5分鐘。高倍鏡或油鏡下計數(shù)200個淋巴細胞，凡結合3個或3個以上的兔紅細胞者為陽性，計算花環(huán)形成細胞的百分率。本次試驗介紹，酶聯(lián)葡萄球菌蛋白A免疫分析法。10. 終止液；2M硫酸方法：1．抗原包被取潔凈的聚苯乙烯微量反應板，（用包被緩沖液稀釋，蛋白含量10微克/毫升），置37℃1小時，棄抗原液，用洗滌液3次每次3分鐘。4．，置暗處15分鐘。計算溶血空斑數(shù)目，則可推算脾內存在的抗體產生細胞總數(shù)。（2）取出脾臟研缽中研碎，加Hanks液2—3毫升，用吸管反復吹打數(shù)次，使細胞分散。用乳頭吸管吹打使沉淀細胞懸起混勻，此即為50倍稀釋的脾細胞。用鑷子尾端將蓋片壓平貼牢（保持小室一定體積）。6．用牙簽粘取少許凡士林益封小室開口。在免疫學實踐，為制備抗體常以抗原性物質（細菌、病毒、類毒素、血清及其他蛋白質）給動物注射?？贵w的產生通常與抗原的質和量、動物種類以及接種途徑有密切關系。在生理鹽水中不發(fā)生自身凝集，與特異血清有高度凝集者可作為菌種。得到原液。%石灰酸生理鹽水洗下H菌菌液置100℃水浴60分鐘，破壞其H抗原即為O菌液。管號123456789101%BaCl2(ml)0. 91%H2SO4(ml)相當菌數(shù)（億/ml）36912151821