翻譯好的羅氏公司tunel試劑盒操作說(shuō)明書(shū)-wenkub
2022-08-31 06:32:03 本頁(yè)面
【正文】 核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’OH末端，并與連接辣根過(guò)氧化酶（HRP，horseradish peroxidase）的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀(guān)察凋亡細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA斷裂，因而沒(méi)有3‘OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測(cè)。具體操作步驟（石蠟包埋切片的檢測(cè)）：1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；2. 用梯度乙醇（100、990、80、70%）各浸洗1次，每次3min；注：上面兩步是針對(duì)石蠟切片樣本的處理4. 用Proteinase K工作液處理組織1530 min 在21–37176。7. 玻片干后，加50μl TUNEL反應(yīng)混合液（陰性對(duì)照組僅加50μl 2號(hào)液）于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃1h。15. 加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察凋亡細(xì)胞（共計(jì)200~500個(gè)細(xì)胞）并拍照。4. TUNEL反應(yīng)液臨用前配制，短時(shí)間在冰上保存。然后進(jìn)行洗凈（100%乙醇）、脫水（二甲苯）透明、封片后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀(guān)察操作。9. 結(jié)果分析時(shí)注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細(xì)胞中可產(chǎn)生大量DNA片斷，從而引起假陽(yáng)性結(jié)果；而有些類(lèi)型的凋亡性細(xì)胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不完全，以及細(xì)胞外的矩陣成分阻止TdT進(jìn)入胞內(nèi)反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致交聯(lián)程度過(guò)高減少固定時(shí)間，或用溶于PBS %多聚甲醛固定熒光淬滅Fluorescence在普通光照10分鐘就會(huì)嚴(yán)重淬滅，需注意避光操作促滲條件不佳
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