【正文】 求得超聲波法提取榛蘑多糖的最佳工藝條件。（6）采用酶法提取多糖，根據(jù)超聲波—酶聯(lián)合提取法最佳工藝條件，只進(jìn)行酶解，不超聲處理，計(jì)算多糖得率。關(guān)鍵詞:榛蘑多糖；超聲波；酶法；提取；工藝優(yōu)化Study on Combined Ultrasonic and Enzyme Hydrolysis Extraction of polysaccharide from Armillaria melleaAbstract The optimum conditions for extraction of polysaccharides from Armillaria mellea were studied. The extraction was assisted with water bath, ultrasonic wave,enzyme technology and ultrasonic wave bined with enzymete chnology. The process parameters were optimized by single factor test and orthogonal experiment to obtain the optimum extraction extraction percent of soluble polysaccharides from Arimillaria mellea with traditional water bath method is %.The optimum extraction conditions of ultrasonic wave method areas follows solidliquid ratio is 1:40,ultrasonic power is 300W, the temperature is 60℃and the extraction time is 40 these conditions, the extraction percent of polysaccharides from Arimillaria mellea is %.The optimum extraction conditions of ultrasonic wave bined with enzyme method are as follows: solidliquid ratio is 1:40, ultrasonic power is 300W, temperature is 60℃, the extraction time is 40 min, the rateof enzyme is %, the value of pH is ,the temperature of enzyme hydrolysisis 50℃,the time of enzyme hydrolysis is 90min. Under these conditions, the extraction percent of polysaccharides from Arimillaria %。 enzyme hydrolysis。然而榛蘑是一種野生菌類(lèi)，人工無(wú)法培育。常被人用于治療羊癲風(fēng)，腰酸腿疼，佝倭病等；經(jīng)常食用榛蘑，可以保護(hù)視力，預(yù)防視力失常。李延平等[6]研究表明，榛蘑多糖通過(guò)刺激骨髓細(xì)胞使幼稚細(xì)胞增多，分化成成熟細(xì)胞，致使分葉核細(xì)胞增多，保護(hù)骨髓造血系統(tǒng)，拮抗環(huán)磷酰胺對(duì)骨髓細(xì)胞的損傷，其作用結(jié)果呈劑量依賴(lài)性關(guān)系。AMP能顯著增強(qiáng)T 細(xì)胞介導(dǎo)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，說(shuō)明可增強(qiáng)小鼠的體液免疫反應(yīng)及細(xì)胞免疫反應(yīng)能力[10]。(2)榛蘑多糖的抗腫瘤作用 經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究可知，榛蘑多糖亦具有抗腫瘤的生理活性。 采用Brandford 法測(cè)定AMP對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC－7221重要蛋白合成的影響。 榛蘑多糖還能夠下調(diào)凋亡抑制蛋白bcl－2的表達(dá)水平，此實(shí)驗(yàn)指出，榛蘑多糖是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抗腫瘤作用的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)AMP－1對(duì)胰島細(xì)胞的分泌也有一定的促進(jìn)作用［12］。陸軍等［14］研究發(fā)現(xiàn)AMP－1能使INS－1細(xì)胞NOS活性降低，NO和MDA含量減少，同時(shí)使SOD的活性增強(qiáng)，增加了GSH的含量，因此在一定濃度范圍的AMP－1對(duì)葡萄糖刺激下INS－1細(xì)胞的胰島素分泌的促進(jìn)作用，可能與AMP－l能夠增加細(xì)胞清除自由基能力有關(guān)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)一部分糖類(lèi)復(fù)合物可通過(guò)清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、調(diào)節(jié)免疫功能、調(diào)節(jié)核酸和蛋白質(zhì)代謝等途徑起到抗氧化作用從而延緩機(jī)體衰老。虞磊［18］等從自由基代謝的角度探討了蜜環(huán)菌菌索多糖的抗衰老機(jī)制，通過(guò)觀察D－半乳糖致衰小鼠模型的跳臺(tái)法和迷宮法學(xué)習(xí)記憶能力，測(cè)定衰老小鼠部分組織中的SOD、MDA、NO、GSH－Px，發(fā)現(xiàn)榛蘑菌索多糖可通過(guò)調(diào)節(jié)生物的機(jī)體免疫功能或者清除自由基來(lái)延緩機(jī)體組織衰老，觀察果蠅的壽命發(fā)現(xiàn)蜜環(huán)菌菌索多糖亦可顯著延長(zhǎng)果蠅的平均壽命和提高果蠅的最長(zhǎng)壽命。因此得出榛蘑多糖對(duì)于低能離子束誘變具有一定的防護(hù)作用［20］。此外，榛蘑多糖對(duì)癲癇、耳鳴、眩暈癥也有一定療效［22］。 超臨界流體萃取(SFE)是以某一介質(zhì)(COH2O、N2)作為萃取劑，在其臨界溫度和臨界壓力之上的條件下，從液體或固體物料中萃取出待分離組分的一種提取分離技術(shù)。廣泛應(yīng)用于植物活性成分，如多糖提取[23]。是提取植物（中藥）中活性成分最常用的方法之一。無(wú)需高壓，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器及玻璃器皿的要求較低，操作簡(jiǎn)單易行。幾乎適合所有的植物性和動(dòng)物性材料。萃取工藝成本低，綜合經(jīng)濟(jì)效益顯著。榛蘑肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，富含蛋白質(zhì)、多糖及多種維生素和礦物質(zhì)，具有極高的食用價(jià)值。 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用苯酚—硫酸比色法測(cè)定多糖含量[24]。加入25ml蒸餾水，在95℃下回流浸提5h，回流結(jié)束后收集濾液； 相同條件下，再將濾渣洗入圓底燒瓶二次浸提， 浸提3次后，合并濾液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮（原料重：濃縮液=1:2） ，向濃縮液內(nèi)加入Sevag試劑除蛋白，按照濾液體積的1/4量加入Sevag試劑（氯仿:丁醇=4:1），直到?jīng)]有乳白色變性蛋白質(zhì)析出后，在150r/min下振蕩20min，4000r/min下離心10min，取上清液，加入3倍體積的95%乙醇沉淀多糖，再離心10min，將得到的沉淀用無(wú)水乙醇洗滌，干燥，得到榛蘑多糖。 ，按一定料液比加入蒸餾水，置于超聲波清洗機(jī)中于一定溫度下作用一定時(shí)間，得到的提取液抽濾，向?yàn)V液內(nèi)加入Sevag試劑除蛋白，在 150r/min下振蕩20min, 離心10min，取上清液，加入3倍體積的95%乙醇沉淀多糖，再離心10min，將得到的沉淀用無(wú)水乙醇洗滌，干燥，得到榛蘑多糖。（3）超聲波功率對(duì)榛蘑多糖提取率的影響 在料液比1:40，超聲溫度60℃，超聲30min的條件下，分別設(shè)定超聲波功率為200、250、300、350、400W，提取多糖，計(jì)算得率。與正交試驗(yàn)中各條件下得到的得率比較，觀察該值是否最高。（2）酶解時(shí)間對(duì)榛蘑多糖得率的影響 %，溫度為50℃，pH ，分別酶解60、90、1150 min，再經(jīng)超聲處理提取多糖，計(jì)算得率。，選用正交表L9(34)研究超聲波—酶法聯(lián)合提取榛蘑多糖的最佳條件[28]超聲波酶法聯(lián)合法提取榛蘑多糖正交因素水平表L9(34)水平因素A加酶率/%B時(shí)間/minC溫度/℃DpH1 2 3 —酶法聯(lián)合提取榛蘑多糖最佳工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn) ，根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳工藝條件進(jìn)行酶解，再經(jīng)超聲波處理后得到提取液，重復(fù)3次，得到最佳條件下的多糖得率。3 結(jié)果與分析 將葡萄糖配制成不同濃度的溶液，采用苯酚硫酸法測(cè)定其在490nm處的吸光值，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制曲線，得到圖31 圖31葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，葡萄糖濃度在0μg/mL30μg/mL區(qū)間，呈線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)為 。固定超聲波功率250W，溫度60℃，超聲時(shí)間30min，改變料液比。 固定料液比1：40，溫度60℃，超聲功率為250W，改變超聲時(shí)間。 固定料液比1:40，溫度60℃，提取時(shí)間30min，改變超聲功率。 固定超聲波功率250W，提取時(shí)間30min，料液比1:40，改變溫度。所以本試驗(yàn)中，把超聲溫度控制在60℃較為適宜。表 31 分析因素與水平水平因素A料液比B超聲時(shí)間/minC功率/WD超聲溫度/℃11:35202505521:40303006031:454035065根據(jù)表31進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到結(jié)果如下 表32正交試驗(yàn)直觀分析表序號(hào)A料液比B超聲時(shí)間/min C超聲功率/WD超聲溫度/℃得率/%11:35202505521:35303006031:35403506541:40203006551:40303505561:4040250607