【正文】 body, 單克隆抗體MD: Molecular Dynamics, 分子動力學NK: Natural Killer, 自然殺傷細胞NLS: Nuclear Location Signal, 核定位信號NMR: Nuclear Magnetic Resonance, 核磁共振NP: Nucleocapsid, 核殼蛋白ORF: Open Reading Frame, 開放閱讀框Ori: Origin, 復制起始位點PDB: Protein Data Bank, 蛋白質數據庫pRb: Retinoblastoma Tumor Suppressor Gene, 視網膜母細胞瘤抑制基因PV: Papillomavirus, 乳頭瘤病毒RH: Hydrated molecular dynamic Radius, 水化分子動力學半徑RNA：Ribonucleic Acid, 核糖核酸RT: Remained Time, 保留時間SAS: Solvent Accessible Surface, 溶劑可及化表面積SCID： Severe Combined Immunodeficiency Mice, 嚴重聯合免疫缺陷小鼠SE: Sedementation Equilibrium, 沉降平衡Size Exclusion Chromatography, 高效分子篩層析SV: Sedimentation Velocity, 沉降速度T: Triangulation number, 三角劃分數即T 值TEM: Transmission Electron Microscopy, 透射電子顯微鏡Th：Helper T lymphocyte, 輔助T淋巴細胞URR：Upstream Regulatory Region, 上游調節(jié)區(qū)Ve: Elution volume of the peotein(s) of interest, 洗脫體積VH: Variable Region of Heavy Chain, 重鏈可變區(qū)VL: Variable Region of Light Chain, 輕鏈可變區(qū)VLP(s): VirusLike Particle(s), 類病毒顆粒VLP：Virus Like Particle, 類病毒顆粒VLP：Viruslike Particle, 病毒樣顆粒WB: Western Blotting, 蛋白印跡實驗WHO: World Health Organization, 世界衛(wèi)生組織GWs: Gental Warts, 生殖器疣前言前言1. HPV研究回顧人乳頭瘤病毒（Human Papilloma Virus，HPV）與棉尾兔乳頭瘤病毒（cottontail rabbit papillomavirus，CRPV）、牛乳頭瘤病毒（bovine papillomavirus, BPV）、犬口腔乳頭瘤病毒（canine oral papillomavirus，COPV）等，同屬于乳頭瘤病毒科（Papillomaviridae），是一類無包膜的小DNA 病毒，主要引起人或動物皮膚粘膜的增生性病變。 major capsid protein L1。綜合上述結果，本研究成功利用大腸桿菌表達系統(tǒng)制備了HPV6 VLP疫苗，驗證了其穩(wěn)定性，有效性及結構正確性，并且對其優(yōu)勢中和表位進行了定位。通過對多個中試批次樣品進行分析，可以發(fā)現所制備的HPV6 VLP在顆粒半徑，保留時間，沉降系數等指標上具有高度的一致性。由于HPV VLP具有復雜的空間構象，而且HPV疫苗的效果也嚴格依賴于其正確的空間構象的形成。實驗結果顯示，本研究制備的HPV6 ，低于對照組中Merck 。研究結果顯示，該工藝不但具有25%左右的較高得率，而且對于目的蛋白具有良好的純化效果。在本研究中并未以包涵體的形式在大腸桿菌中表達重組蛋白HPV6N5CL1，而是將目的蛋白以非融合的形式可溶地表達于大腸桿菌中。但是上述兩種疫苗均采用真核表達系統(tǒng)，生產成本高，產品價格昂貴，難以在發(fā)展中國家推廣。尖銳濕疣主要由HPV6及HPV11感染所引起，其中由HPV6感染所引起的占到了70%。學校編碼：10384 分類號 密級 學號：B200426027 UDC 博 士 學 位 論 文 大腸桿菌來源的HPV6 L1重組蛋白的基礎及應用研究Basic and Application Studies on E. coli Derived HPV6 L1 Rebinant Protein潘暉榕指導教師姓名：夏寧邵 教授專 業(yè) 名 稱：生物化學與分子生物學論文提交日期：2008年11月論文答辯時間：200年12月學位授予日期： 答辯委員會主席：田德英 評 閱 人： 2008年 11 月161目錄目錄目錄 I摘要 1Abstract 3縮略詞 5前言 71. HPV研究回顧 72. HPV的結構 7. HPV基因組結構 7. HPV的早期蛋白 8. HPV晚期蛋白與病毒結構 10. 二硫鍵與HPV 顆粒結構 13. L1蛋白的自組裝 14. L2蛋白 153. HPV的分型 164. HPV的感染以及致病機制 175. HPV的免疫 19. 抗HPV的天然免疫 20. 抗HPV的特異性免疫 20. HPV免疫低反應性以及免疫逃逸的機制 226. HPV感染的診斷 23. HPV DNA檢測 23. HPV抗體檢測 247. HPV流行情況以及所致疾病 24. 高危型與低危型HPV 24. HPV感染的傳播 25. HPV感染的流行情況 25. 高危型HPV感染所致疾病 29. 低危型HPV感染所致疾病 298. HPV疫苗研究現狀 32. HPV疫苗的基本要求 32. 現有的HPV疫苗 339. 蛋白質結構研究及預測 38. 蛋白質結構研究的實驗方法 38. 蛋白質結構研究的預測方法 39. 蛋白結構預測在抗體模擬上的應用 45. 抗體模擬技術的應用前景： 4610. B細胞抗原表位定位的研究方法 47. B細胞表位的預測法 47. B細胞表位定位的實驗方法 4911. 本文研究的思路，目的和意義 51材料與方法 531. 材料 53. 主要設備 53. 菌株、質粒、實驗動物 54. 工作站、軟件及其使用模塊 55. 酶和單抗 552. 方法 55 常用溶液及培養(yǎng)基配制 55 常規(guī)分子生物學實驗方法 57 HPV6 L1相關的克隆構建，表達純化以及檢測方法 62 疫苗原液及成品檢定方法 66 分析型超速離心機相關操作 67 蛋白質晶體培養(yǎng) 69 圓二色光譜測定 70 抗HPV6標準血清的制備 70 HPV6單抗的制備,鑒定與CDR區(qū)測序 71 分子模擬與分子對接 77結果與分析 81第一部分HPV6 VLP疫苗的研究 811. HPV6 VLP小量制備方法的建立 81. 大腸桿菌重組表達質粒pTOT76N5C的構建 81. HPV6N5Ll在大腸桿菌中的可溶性表達 82. 重組蛋白HPV6N5Ll的色譜純化 84. HPV6VLP組裝條件的摸索 87. 小結 902. HPV6 VLP疫苗的中試研究 90. HPV6N5CL1的高密度發(fā)酵表達 90. HPV6N5CL1的中試規(guī)模粗純 90. HPV6N5CL1的中試規(guī)模色譜純化 91. HPV6 VLP的大量組裝 92. HPV6 VLP疫苗中試工藝的評價 93. 小結 953. HPV6 VLP疫苗免疫原性的考察 964. HPV6 VLP疫苗原液穩(wěn)定性的考察 985. 第一部分小結 103第二部分HPV6 VLP疫苗的結構分析及表位定位 1031. HPV6 VLP疫苗的結構分析 103. HPV6N5CL1一級結構的研究： 103. HPV6N5CL1二級結構的研究 105. HPV6N5CL1 五聚體結構的研究 105. HPV6N5CL1 VLP結構的研究 113. 小結 1152. HPV6 VLP疫苗表位的定位 115. HPV6單抗的篩選以及鑒定 116. 利用分子對接技術預測HPV6 VLP疫苗的優(yōu)勢表位 121. 利用同源掃描法進行HPV6 VLP疫苗優(yōu)勢中和表位的定位 128. 預測表位與實驗確定表位的比較 131. 小結 1323. 第二部分小結 133討論 1341. 大腸桿菌表達系統(tǒng)在HPV VLP疫苗研究中的應用 1342. HPV抗體的檢測 1363. HPV疫苗的發(fā)展趨勢 139小結與展望 143參考文獻 144致謝 153在校期間發(fā)表論文及申請專利 154摘要大腸桿菌來源的HPV6 L1重組蛋白的基礎及應用研究摘要人乳頭瘤病毒（Human Papillomavirus HPV）能夠引起肛生殖器部位的多種良性及惡性病變。因此，一種有效的HPV6疫苗能夠顯著減少尖銳濕疣的發(fā)生和傳播。而大腸桿菌表達系統(tǒng)具有培養(yǎng)條件簡單，生產成本低廉的突出優(yōu)點。所表達的HPV6N5CL1蛋白在經過鹽析沉淀，復溶，陽離子交換色譜，疏水相互作用色譜這一系列純化步驟之后，其純度能夠達到96%以上。經過純化，目的蛋白的純度能夠達到96%以上，而內毒素，外源DNA含量均能夠符合藥典要求。在穩(wěn)定性研究中，HPV6 VLP疫苗原液在25℃放置7Day后，其平均水化半徑，HPLC保留時間，沉降系數，體外相對抗原含量均未發(fā)生明顯變化。因此本研究在成功制備HPV6 VLP疫苗的基礎上進一步對該疫苗的結構及抗原表位進行研究，以闡明HPV6 VLP的結構及表位特征，為建立全面的疫苗質控體系及進行疫苗設計奠定基礎。在表位研究中，本研究篩選得到了HPV6 優(yōu)勢中和單抗7A8,13H5，這兩株單抗同時還具有HPV6/11交叉中和活性。這些工作將為HPV6 疫苗研究及新型HPV疫苗設計提供參考。 E. coli expression system。對于乳頭瘤病毒最早的認識始于20世紀初，當時的研究發(fā)現，一些含有人或動物疣組織成分的無菌濾過液可以傳播疣。隨著20世紀70年代分子生物學技術的飛速發(fā)展，對于PV的認識不斷深入，其與人類疾病的關系也不斷被揭示：在1981年和1983年，引起人生殖器粘膜疣的HPV6, HPV11分別被發(fā)現[1, 2]；zur Hausen在1983和1984年成功地從宮頸癌組織中分離出HPV16和HPV18病毒株[3, 4]，從而闡明了某些型別HPV感染與宮頸癌發(fā)生的密切關系。該發(fā)現標志著HPV研究從理論積累進入了應用開發(fā)的全新領域[5]。其基因組可以分為含有大部分的順式作用元件，控制早期、晚期基因的表達和病毒組裝的長控制區(qū)（long control region，LCR）；編碼早期非結構蛋白（E1E8）的早期開放閱讀框（open reading frame,ORF）和編碼晚期衣殼蛋白（L1和L2）的晚期開放ORF。E1是一個六聚體的解螺旋酶，與細胞的DNA解螺旋酶具有功能和結構的同源性，能在LCR內的E1依賴性的復制起始位點（E1 ori）處結合DNA聚合酶α和伸展的DNA，對于早期的病毒基因組復制和基因組在基底上皮層中的維持極為重要[7]。E4蛋白的功能目前尚不十分清楚，但是有研究表明，該蛋白可能與病毒顆粒的釋放有關。E6蛋白轉化細胞的機制相當復雜，可以通過多個細胞通路對細胞的生長特性進行調解從而導致細胞永生化。致癌型與非致癌型HPV的E6蛋白在性質上的差異主要體現在其與P53的結合活性上[11]。通過該區(qū)域，E7蛋白能夠與與pRB家族蛋白結合，抑制其活性，從而使細胞進入S期。目前，有多種證據證表明，高危型HPV E6/E7蛋白可以協(xié)同作用滅活多種細胞周期調控蛋白，使得細胞生長失去正常調控。圖2E6，E7在宮頸癌形成中作用[11] The roles of E6, E7 in the development of cervical cancer. HPV晚期蛋白與病毒結構圖3 HPV 顆粒電鏡圖 [17] TM of HPV virion人乳頭瘤病毒呈球形，為直徑約為5560nm的無包膜DNA病毒（見圖3）。次要衣殼蛋白L2也與L1一起參與了病毒顆粒的組裝。HPV L1蛋白大約有500個氨基酸殘基組成，分子量約為5560kD。圖中所示各個字母B到I表示β折疊桶中的各個片段，CHEF4個片段與BIDG4個片段分別組成了該結構中反向平行的兩個片層，在各個片段之間有BC、CD、DE、EF、FG和HI環(huán)狀連接肽連接。HPV16 L1蛋白476505位氨基酸在T=1的“小”VLP中是以“折返臂”的模式存在：該結構重新折返，返回所在的五聚體，折返產生的突出末端與相鄰的兩個五聚體的相應部位相結合（見圖6）。在五聚體內部，各個L1蛋白單體緊密接觸。此外的研究進一步表明，在體外利用氧化劑促進半胱氨酸之間二硫鍵的形成將會促進五聚體組裝為顆粒[24]。通過對HPV16L1蛋白上的Cys進行突變研究可以發(fā)現，當Cys427被突變之后，HPV16 L1只能組成五聚體，無法進一步組裝成為顆粒，這說明該半胱氨酸參與了五聚體之間的交聯。如上所述，L1蛋白中的二硫鍵在V