大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)詳細(xì)表格-wenkub
2024-10-03 23 本頁面
【正文】 ，可以被 IPTG所誘導(dǎo)，所以參加誘導(dǎo)物后，可以誘導(dǎo)啟動子下游的外源基因的表達(dá)。 大腸桿菌格外偏愛使用終止子 UAA，尤其是在其后加上 U形成 UAAU四聯(lián)核苷酸的情況下，轉(zhuǎn)譯終止的效率便會得到進(jìn)一步的增強(qiáng)。 4 第四頁，共三十六頁。 3 第三頁，共三十六頁。到目前為止已經(jīng)成功開展了許多表達(dá)載體和相應(yīng)的宿主菌。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 1 第一頁，共三十六頁。 表達(dá)過程：包含啟動子、目的基因編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止序列的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，可以利用受體細(xì)胞的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯體系表達(dá)產(chǎn)生目的蛋白。 2. 轉(zhuǎn)錄終止子 啟動子封堵作用 ：由一個上游啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄作用，當(dāng)其通讀過下游啟動子時，便會使該啟動子的功能受到抑制，將這種由一個啟動子的功能活性抑制另一個啟動子轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象，叫做啟動子封堵作用。 4. 轉(zhuǎn)譯起始序列 5’ 末端結(jié)構(gòu)特征，決定 mRNA的轉(zhuǎn)譯起始效率。 5 第五頁，共三十六頁。 理論上，但凡具有包括控制區(qū)段在內(nèi)的 lac操縱子的質(zhì)粒，都根本上具備了用作克隆基因表達(dá)載體的條件。 質(zhì)粒的構(gòu)建： 將含有 lac啟動子的 HaeIII 酶切片斷，經(jīng)平末端連接，克隆到經(jīng) EcoR1切割并對其粘性末端進(jìn)行填補(bǔ)修復(fù)的 pBR322質(zhì)粒上。這種表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)是，它所合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高于 lac啟動子表達(dá)載體系統(tǒng)，并且是誘導(dǎo)型的。 13 第十三頁，共三十六頁。攜帶 λ PL啟動子的載體使用溫度敏感的 E. coli cI突變體。 這個質(zhì)粒表達(dá)載體含有 MS2聚合酶基因開始的 98個密碼子，不具有轉(zhuǎn)譯起始密碼子的外源片斷也能實(shí)現(xiàn)表達(dá)。 16 第十六頁，共三十六頁。在細(xì)胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬箘體啟動子的情況下，大腸桿菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過 T7噬箘體轉(zhuǎn)錄體系。在載體中，這些表達(dá)信號組成一個 cassette。這可能是鏈間配對形成的次級結(jié)構(gòu)可以影響核糖體與其結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。如ompA或者 malE基因，這樣重組蛋白可以被輸出到細(xì)胞外，進(jìn)入培養(yǎng)基或者質(zhì)膜空間。 18 第十八頁，共三十六頁。影響其形成的關(guān)鍵因素：電荷的平均數(shù)、形成轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基組分 20 第二十頁，共三十六頁。 在周質(zhì)中表達(dá)的蛋白，需要信號肽序列才能從細(xì)胞質(zhì)中穿過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜進(jìn)入周質(zhì)?！膊皇翘貏e有效的程序〕 2. 誘導(dǎo)大腸桿菌細(xì)胞的外膜發(fā)生有限的滲漏，導(dǎo)致胞內(nèi)的蛋白質(zhì)向胞外培養(yǎng)基方向分泌。另一個是大腸桿菌容易培養(yǎng) ,可以獲得較高產(chǎn)量的目的蛋白。 近幾年來，國內(nèi)外大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的重點(diǎn)已從構(gòu)建各種表達(dá)載體，建立新的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到完善現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng)，解決表達(dá)系統(tǒng)中還存在的缺陷等方面。 大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢 ? 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能 ? 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng) ? 內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確
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