【正文】 A 片段末端的一條鏈多出一至幾個(gè)核苷酸，這樣的末端稱(chēng)為黏性末端。真正有用的是Ⅱ型內(nèi)切酶。 原核生物染色體基因組 質(zhì)?；蚪M 所含基因數(shù)目較少，是目的基因的次要來(lái)源 病毒（噬菌體）基因組 線粒體、葉綠體基因組 13 二 、 分離目的基因的途徑 在分離目的基因時(shí)，可根據(jù)目的基因所在基因染色體基因組的大小、目的基因的大小、序列是否已知等因素，采用不同的方法分離目的基因。 專(zhuān)一性強(qiáng) 反轉(zhuǎn)錄法 工作量大，盲目，分離出來(lái)的有時(shí)并非一 個(gè)基因 。 目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖的速度非?？?，在很短的時(shí)間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。 從供體細(xì)胞的 DNA 中直接分離基因（如 “鳥(niǎo)槍法 ”） 、人工合成基因 （反轉(zhuǎn)錄法、化學(xué)合成法）。將人的有關(guān)基因轉(zhuǎn)移到動(dòng)物細(xì)胞，得到諸如含有人干擾素的羊奶等。 遺傳密碼是通用的。 （ 2）其他幾種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)： 基因是可以轉(zhuǎn)移的。 可以采用特定的限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)基因進(jìn)行人為切割。 基因工程的基本特點(diǎn)是，分子水平操作，細(xì)胞水平表達(dá)。 （五） 生物技術(shù)的安全性及其對(duì)倫理、道德、法律的影響。主要有傳統(tǒng)的通用型化工原料如乙醇、丙酮、丁醇等產(chǎn)品。 （四）制造工業(yè)原料生產(chǎn)貴 重金屬?；蛑委熅褪菍?duì)相關(guān)的基因進(jìn)行抑制或調(diào)整。所以繼美國(guó)之后，歐盟國(guó)家 、日本、俄羅斯、加拿大、澳大利亞和我國(guó)也相繼啟動(dòng)了人類(lèi)基因組計(jì)劃。 （ 2）從轉(zhuǎn)基因羊的羊奶中提取出治療心臟病的藥物 tPA。 （ 2） DNA 探針，主要用來(lái)診斷遺傳性疾病和傳染性疾病。美國(guó)首先采用大腸桿菌生產(chǎn)了人類(lèi)第一個(gè)基因工程藥物 —— 人生長(zhǎng)激素釋放抑制激素。此外，還有采用基因打靶技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因克隆羊、利用乳腺生產(chǎn)藥用蛋白的轉(zhuǎn)基因羊、用于人體器官移植的轉(zhuǎn)基因豬。 5 1997 年 2 月英國(guó) Roslin 研究所用綿羊乳腺細(xì)胞培育出一只小羊 —— 多莉 。 （ 4）生物固氮，減少化肥使用量。 （ 2）植物種苗的工廠化生產(chǎn) 。以基因工程為核心，帶 4 動(dòng)了現(xiàn)代發(fā)酵工程、現(xiàn)代酶工 程、現(xiàn)代細(xì)胞工程的發(fā)展，形成了具有劃時(shí)代意義和戰(zhàn)略?xún)r(jià)值的現(xiàn)代生物技術(shù)。 1961 年 Khorana、 Nirenberg 破譯了遺傳密碼，揭開(kāi)了 DNA 編碼的遺傳信息是如何傳遞給蛋白質(zhì)這一秘密。 （二）現(xiàn)代生物技術(shù)。發(fā)酵技術(shù)和酶技術(shù)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、制革和農(nóng)產(chǎn)品加工等部門(mén)。 1676 年，荷蘭人 Leeuwenhoek（ 1632～ 1723） 制成了能放大 170～ 300 倍的顯微鏡，并首先觀察到了微生物。在石器時(shí)代后期，我國(guó)人民就會(huì)利用谷物造酒，這是最早的發(fā)酵技術(shù)。 （ 5）高風(fēng)險(xiǎn)，高競(jìng)爭(zhēng)帶來(lái)高風(fēng)險(xiǎn)。 （ 1）高效益，可帶來(lái)高 額利潤(rùn)。 生物技術(shù)涉及學(xué)科。 五大工程間的關(guān)系。 （ 4）目的：包括疾病的預(yù)防、診斷與治療，食品的檢驗(yàn)、環(huán)境污染的監(jiān)測(cè)和治理等。 （ 1）現(xiàn)代生命科學(xué)：目前，普遍認(rèn)為現(xiàn)代生命科學(xué)系統(tǒng)的建立開(kāi)始于 16 世紀(jì)。它的基本特征是人們對(duì)生命現(xiàn)象的研究牢固地植根于觀察和實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上。 二 、 生物技術(shù)的種類(lèi)及其相互關(guān)系： 生物技術(shù)種類(lèi) 。 基因工程是核心，帶動(dòng)其他四大工程的發(fā)展，四大工程的發(fā)展又促使基因工程 發(fā)展更迅猛。 現(xiàn)代生物技術(shù)以分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等幾乎所有生物科學(xué)次級(jí)學(xué)科為支撐，又結(jié)合了化學(xué)、化學(xué)工程學(xué)等生物學(xué)領(lǐng)域之外的尖端基礎(chǔ)學(xué)科，從而形成一門(mén)多學(xué)科相互滲透的綜合性學(xué)科。 （ 2）高智力，具有創(chuàng)造性和突破性。 （ 6）高勢(shì)能，對(duì)國(guó)家的政治、經(jīng)濟(jì)、文化和社會(huì)發(fā)展有很大的影響，具有很強(qiáng)的滲透性和擴(kuò)散性。在公元 10 世紀(jì)，我國(guó)就有了預(yù)防天花的活疫苗。 19 世紀(jì) 60 年代，法國(guó)科學(xué)家 （ 1822～ 1895）首先證實(shí)發(fā)酵是由微生物引起的，并首先建立了微生物的純種培養(yǎng)技術(shù)。 本 世紀(jì)初，遺傳學(xué)的建立及其應(yīng)用，產(chǎn)生了遺傳育種學(xué)，被譽(yù)為“第一次綠色革命”。 現(xiàn)代生物技術(shù)是以 70 年代 DNA 重組技術(shù)的建立為標(biāo)志的。 1972 年 Beng 首先實(shí)現(xiàn)了 DNA 體外重組技術(shù)，標(biāo)志著生物技術(shù)的核心技術(shù) ——基因工程技術(shù)的開(kāi)始。 下圖是針對(duì)蘇格蘭羊的轉(zhuǎn)基因技術(shù)： 四、生物技術(shù)對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的影響： （一）改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、解決食品短缺。 我國(guó)已建立了多種植物試管苗的生產(chǎn)線，如葡萄、蘋(píng)果、香蕉、柑橘、花卉等。 （ 5）生物農(nóng)藥，生產(chǎn)綠色食品。這意味著動(dòng)物體細(xì)胞同樣有可能進(jìn)行動(dòng)物的大量、快速無(wú)性繁殖。 （二）提高生命質(zhì)量，延長(zhǎng)人類(lèi)壽命 。 此外，還開(kāi)發(fā)了 人生長(zhǎng)激素、表皮生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子、 a干擾素、纖維素酶 、抗血友病因子、紅細(xì)胞生成素、尿激酶原、白細(xì)胞介素 集落刺激因子、乙肝疫苗等等。 （ 3） 1975 年，英國(guó)科學(xué)家米爾斯坦利用細(xì)胞融合技術(shù)將一個(gè) B 型淋巴細(xì)胞，和一個(gè)骨髓瘤細(xì)胞融合在一起形成一個(gè)雜交瘤細(xì)胞，其產(chǎn)生的抗體叫做單克隆抗體。 6 人類(lèi)基因組計(jì)劃（ HGP）。 1990 年開(kāi)始啟動(dòng)，計(jì)劃 15 年內(nèi)完成人類(lèi)全部基因組 30 億個(gè)堿基對(duì)的排列順序的測(cè)定和圖譜分析。所有的藥物開(kāi)發(fā)，是先在靶基因上實(shí)驗(yàn)的。 利用微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中積累的代謝產(chǎn)物，生產(chǎn)食品工業(yè)原料，種類(lèi)繁多。在冶金工業(yè)方面，高品位富礦不斷耗盡。 8 第二章 基因工程 第一節(jié) 基因工程概論 一、基因工程的含義： 應(yīng)用人工方法把生物的遺傳物質(zhì)，通常是 DNA 分離出來(lái)，在體外進(jìn)行切割、拼接和重組。 具體 如下所示： 基因工程的別名：基因拼接技術(shù)或 DNA 重組技術(shù) 操作環(huán)境：生物體外 操作對(duì)象：基因 操作水平： DNA 分子水平 基本過(guò)程：剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá) 結(jié)果：人類(lèi)需要的基因產(chǎn)物 二、基因工程研究的理論依據(jù) 不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)。 （ 1） 限制性核酸內(nèi)切酶 EcoR I 的酶切位點(diǎn) ： 來(lái)源： 主要從原核細(xì)胞分離。 基因可以在同一染色體上轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)座子），可以在不同染色體間轉(zhuǎn)移（重組），也可在人為條件下在不同物種之間轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)基因）。 這決定了某一基因?qū)肴魏畏N類(lèi)的生物中，由其所編碼的 Pro 中的氨基酸序列相同。 基因可以通過(guò)復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代。常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。 （ 4）目的基因的 檢測(cè)和表達(dá)： 檢測(cè) ：通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記基因的有無(wú)來(lái)判斷目的基因是否導(dǎo)入。 操作簡(jiǎn)便廣泛使用 鳥(niǎo)槍法 12 四、基因工程研究最突出的優(yōu)點(diǎn) 打破了常規(guī)育種難以突破的物種之間的界線，可以使基因在不同生物之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移和表達(dá)。目前，主要采用以下四種方法分離目的基因 ： （ 1）酶切直接分離法； （ 2） PCR 擴(kuò)增法； （ 3）化學(xué)合成法； （ 4）構(gòu)建基因組文庫(kù)或 cDNA 文庫(kù)分 離法。 （ 3）限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)： 限制性核酸內(nèi)切酶在 DNA 上能夠識(shí)別的核苷酸序列稱(chēng)為識(shí)別序列或者識(shí)別位點(diǎn)。 3?端比 5?短長(zhǎng)的稱(chēng)為 3?黏性末端；反之，稱(chēng)為 5?黏性末端。 （ 2） PCR 的基本原理 ： PCR 反應(yīng) 是模仿細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的 DNA 復(fù)制過(guò)程進(jìn)行的，以 DNA 互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)靶 DNA 變性，引物與模板 DNA（待擴(kuò)增 DNA）一側(cè)的互補(bǔ)序列復(fù)性雜交，耐熱性 DNA聚合酶催化引物延伸等過(guò)程的多次循環(huán)，產(chǎn)生待擴(kuò)增的特異性 DNA 片段。 9095℃（ 30 秒），雙鏈 DNA 變性成兩條單鏈，作為 PCR 反應(yīng)的模板。 7075℃ 下 12 分鐘，耐熱性 DNA 聚合酶在引物的 3?端上加上核苷酸。 第七步：反應(yīng)終止。 ■ dNTP：四種脫氧核糖核苷酸單體（ dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP、） 。因此， PCR 經(jīng)過(guò) n 次循環(huán)后，待擴(kuò)增的 DNA 片段理論上可達(dá)到原拷貝數(shù)的 2n 倍。 （ 7）圖示 PCR 技術(shù)的反應(yīng)過(guò)程： 17 化學(xué)合成目的基因： 目前，利用 DNA 合成儀，可根據(jù)待合成的 DNA 片段預(yù)定的核苷酸順序，自動(dòng)地將 4種核苷酸單體（ A、 T、 C、 G）按 3? → 5?方向連接成寡核苷酸片段。若這個(gè)群體中只貯存某種生物基因組的部分遺傳信息，稱(chēng)部分基因組文庫(kù)。進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性克隆子的重組DNA 進(jìn)行測(cè)序，與已知基因的核苷酸序列進(jìn)行比較和鑒定，確定是否是待分離的目的基因。 二、基因克隆載體應(yīng)具備的條件： 在合適的位置必須含有允許外源 DNA片段組入的克隆位點(diǎn)。 以 pBR322質(zhì)粒載體為例，說(shuō)明以上三個(gè)特點(diǎn)： 22 三、 基因克隆載體發(fā)展階段： 第一個(gè)階段 ：質(zhì)粒載體、λ噬菌體載體、柯斯質(zhì)粒載體為主。 第三個(gè)階段 ：雙元細(xì)菌 人工染色體和可轉(zhuǎn)化人工染色體。 特性： a. pBR322 大小為 ，復(fù)制起始點(diǎn)來(lái)源于 pMB1。分別位于 Tet抗性基因和 Amp抗性基因中。 c. 具有較高的拷貝數(shù) 10003000/細(xì)胞 。 （ 3）多克隆位點(diǎn)區(qū)（ MCS）：由人工合成的多個(gè)單一酶切位點(diǎn)構(gòu)成。冠癭瘤的形成是E c o S ac K p n S m a B am X b a S al P s t S p h H i nRI I I I H I I I I I d I I IpU C 1 8pU C 1 9H i n S p h P s t S al Xb a B am S m a K p n S ac E c od I I I I I I I H I I I I RIApO r iL a c Z( 8kb )r 25 由于 Ti(tumor inducing) 質(zhì)粒導(dǎo)致的?？梢詫⒒虿迦?TDNA中，細(xì)菌就可以將它整合到植物的染色體 DNA中。 λ 噬菌體克隆載體 （ 1） λ 噬菌體的組成 ： 一種溫和的誘導(dǎo)性噬菌體，其基因組除在 539。 λ噬菌體的基因組長(zhǎng)達(dá) 50Kb， 共 61個(gè)基 因，其中 38個(gè)較為重要。 在基因克隆中的二者的用途不盡相同。插入型的 λ 載體又可以分為免疫功能失活的（ inactivatiort of immunityfunction）和大腸桿菌 β半乳糖苷酶失活的（ inactlvatlon of E． coli βgalactosidase）兩種亞型。 ② β半乳糖苷酶失活的插入型載體：它們的基因組中含有一個(gè)大腸桿菌的 lac5 區(qū)段，其中編碼著 β半乳糖著酶基因 lac Z。 λ NM781 便是其中的一個(gè)代表。 第二，將上述 所得的人 DNA 臂同外源 DNA 片段連接。這種由寄主細(xì)胞捕獲裸露的噬菌體 DNA 的過(guò)程叫做轉(zhuǎn)染（ transfection），它有別于以噬菌體顆粒為媒介的轉(zhuǎn)導(dǎo)（ kransduction）。 B. λ DNA 的體外包裝 。將這兩種不同突變型的噬菌體的提取物混合起來(lái)，便能夠在體外裝配成有生物活性的噬菌體顆粒。上限不得超過(guò)其正常野生型 DNA 總量的 5％左右，而低限又不得少于正常野生型 DNA 總量的 75％。 （ 2）構(gòu)建 植物病毒 克隆載體的克隆策略： 制備克隆載體時(shí)要經(jīng)過(guò)改造，消除其對(duì)植物的致病性，保持其轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)植物細(xì)胞的 28 能力。構(gòu)建痘苗病毒克隆載體一般采用同源重組的方法：將外源基因兩端連接上痘苗病毒 DNA上具有的基因，如 TK（胸苷激酶）基因及 HA（血凝素 ）基因，通過(guò)同源重組，將外源目的基因整合到痘苗病毒基因組上。 人工染色體為基因組圖譜制作、基因分離以及基因組序列分析提供了有用的工具。 （ 3）人工染色體載體按結(jié)構(gòu)分為線性和環(huán)形： 線形人工染色體載體：必須含有端粒、著絲點(diǎn)、復(fù)制起始區(qū)。 29 第 四 節(jié) DNA重組 一、重組 DNA技術(shù)的定義 重組 DNA技術(shù)又稱(chēng)為基因克隆或分子克隆技術(shù)， 包括了一系列的分子生物學(xué)操作步驟。 二、重組 DNA操作 的 一般步驟 （ 1）獲得目的基因； （ 2）與克隆載體連接，形成新的重組 DNA分子； （ 3）用重組 DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳； （ 4）對(duì)轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定； （ 5）對(duì)獲 得外源基因的細(xì)胞或生物體通過(guò)培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)