【正文】 位，染色約1min。接種環(huán)用后必須再次燒灼滅菌。（4）95％乙醇（5）番紅染液：%番紅的乙醇溶液10mL，蒸餾水100mL混合過濾。應用新鮮幼齡的菌體進行涂片。根據(jù)細菌對此種染色法的反應不同，可將細菌分為兩大類，菌體呈者為革蘭氏陽性菌，呈紅色者為革蘭氏陰性菌。 簡單染色法利用細菌在中性環(huán)境中帶負電荷，而堿性染料如結(jié)晶紫、美藍、堿性復紅、番紅等解離后帶正電荷，細菌與染料具有親和力而被著色的原理，采用一種單色染料對細菌進行染色，稱為簡單染色法。顯微鏡的金屬油漆部件和塑料部件，可用軟布沾中性洗滌劑進行擦拭，不要使用有機溶劑。粗、細調(diào)節(jié)螺旋、聚光器螺旋和標本移動器等機械部分要靈活而不松動，如不靈活可在滑動部位滴加少許潤滑油。不使用時，用有機玻璃或塑料布防塵罩罩起來。用擦鏡紙清潔其它物鏡及目鏡；用綢布清潔顯微鏡的金屬部件。另外應特別注意，不要因在下降鏡頭時或提升載物臺時用力過猛或調(diào)焦時誤將粗調(diào)節(jié)器向反方面轉(zhuǎn)動而損壞鏡頭及載玻片。對于不等焦的顯微鏡，用粗調(diào)節(jié)器下降載物臺或升高鏡筒，使物鏡逐漸遠離玻片，在標本觀察區(qū)滴加鏡油，然后將油鏡轉(zhuǎn)至鏡筒下方，須在側(cè)面注視下，用粗調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)上升載物臺或下降鏡筒，使物鏡與玻片接近，將油鏡前端浸入鏡油中，并幾乎與標本相接。適當調(diào)節(jié)聚光器光圈及視野亮度，用細調(diào)節(jié)器使物像清晰，利用推進器移動標本，仔細觀察并記錄所觀察到的結(jié)果。如有內(nèi)置光源燈可通過調(diào)節(jié)電壓以獲得適當?shù)恼彰髁炼取＃?） 標本放置下降載物臺或升高鏡筒，使物鏡遠離載物臺。其強弱可進行調(diào)節(jié)。虹彩光圈附于聚光器內(nèi)部，可開大或縮小，以調(diào)節(jié)進入鏡頭的光線的強弱。目鏡是把接物鏡放大的實像再放大一次，并把物像映入觀察者的眼中。物鏡轉(zhuǎn)換器安裝在鏡筒的下端，其上裝有3～4個不同放大倍數(shù)的物鏡，可以通過轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器選用合適的物鏡。鏡筒上端插入目鏡，下端與物鏡轉(zhuǎn)換器相接。 實驗內(nèi)容 顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)普通光學顯微鏡由機械和光學兩大部分組成。 器材和材料 儀器或其它用具光學顯微鏡、鏡紙、吸水紙等。 溶劑或試劑⑴鏡油：香柏油或石蠟油。 顯微鏡構(gòu)造示意圖1. 目鏡；2. 鏡筒；3. 鏡臂；4. 標本移動器；5. 粗動限位器；6. 粗調(diào)節(jié)器；7. 細調(diào)節(jié)器；8. 鏡座；9. 反光鏡；10. 虹彩光圈；11. 聚光器；12. 載物臺；13. 物鏡；14. 物鏡轉(zhuǎn)換器（引自錢存柔、黃儀秀. 微生物學實驗教程. 北京：北京大學出版社. 1999）⑴機械部分鏡座是顯微鏡的基座，使顯微鏡能平穩(wěn)地放置在桌子上。載物臺是放置標本的地方。調(diào)節(jié)器安裝在鏡臂的基部，是調(diào)節(jié)物鏡與被檢標本之間距離的裝置，通過轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器和細調(diào)節(jié)器便可清晰地觀察到標本。通常有10等規(guī)格。光圈大小應適當，使物像能得到更清晰的效果。 顯微鏡的使用方法（1） 顯微鏡的取用和放置從顯微鏡箱或柜內(nèi)取出顯微鏡時，應一手提鏡臂，另一手托鏡座，讓顯微鏡直立，防止目鏡從鏡筒中脫落。將低倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，把標本玻片置于載物臺上，用標本夾夾住，移動推進器使觀察對象處在物鏡的正下方。再由目鏡觀察，同時轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器下降載物臺或升高鏡筒，使物鏡逐漸遠離玻片，標本在視野中顯現(xiàn)后，再使用細調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)至圖像清晰。在一般情況下，當物像在一種物鏡中已清晰聚焦后，轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器將其他物鏡轉(zhuǎn)到工作位置進行觀察時，物像將保持基本準焦狀態(tài)，這種現(xiàn)象稱為物鏡的同焦。將聚光器升到最高位置并開足光圈，調(diào)節(jié)照明，使視野的亮度合適，用粗調(diào)節(jié)器上升鏡筒或下降載物臺，使物鏡緩慢離開玻片，直至視野中出現(xiàn)物像，并用細調(diào)節(jié)器使其清晰準焦為止。（6） 顯微鏡用畢后的處理用粗調(diào)節(jié)器使物鏡遠離玻片，取下載玻片。放平反光鏡，把聚光鏡降下，將物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，將各部分還原，歸置鏡箱中。也可套上布罩后放入顯微鏡箱內(nèi)或顯微鏡柜內(nèi)，并在箱或柜內(nèi)放置干燥劑。（4） 顯微鏡的目鏡、物鏡、聚光器和反光鏡等光學部件必須保持清潔，防止長霉。（5） 用油鏡觀察后，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后用擦鏡紙沾少許鏡頭清洗液擦拭，最后用干凈的擦鏡紙擦干。適用于菌體一般形態(tài)的觀察。其原因是由于這兩類細菌細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。 試劑及染液（1）齊氏石炭酸復紅染液：A液：，95%乙醇10mLB液：，蒸餾水95mL將A、B二液混合搖勻過濾。 器材無菌水、顯微鏡、擦鏡紙、吸水紙、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、石蠟油、鏡頭清洗液。干燥 涂布后，待其在空氣中自然晾干。（3）水洗斜置載玻片，傾去染液，用細水流輕輕沖去多余染料，直至流水變清為止。注意各種細菌的形態(tài)和細胞排列方式。方法與簡單染色相同。脫色 用濾紙吸去玻片上的殘水，乙醇滴加在涂片上靜置30S立即水洗。復染 滴加番紅復染1min后水洗并干燥。若研究工作中要確定未知菌的革蘭氏反應時，則需同時用已知菌進行染色作為對照。但一般培養(yǎng)基的配制程序及其他的準備工作卻大致相同，例如器皿的準備、培養(yǎng)基的配制和分裝、棉塞的制作、培養(yǎng)基的滅菌、斜面與平板的制作以及培養(yǎng)基的無菌檢查等基本環(huán)節(jié)大致相同。（3）玻璃器皿：培養(yǎng)皿、試管、150mL大試管、移液管（1mL和10mL）、錐形瓶（250mL、500mL）、1000mL燒杯、量筒、玻璃漏斗等。培養(yǎng)皿、試管、錐形瓶等較大的器皿可用洗衣粉或去污粉洗滌，并用清水沖洗干凈；移液管先用洗液浸泡，再用清水沖洗干凈。②移液管的包裝：用細鐵絲將少許棉花塞入移液管的吸端，~（避免外界及口中雜菌吸入管內(nèi)，防止菌液等吸入口中）。根據(jù)實驗所需，可單支也可多支包裝。 棉塞制作過程（引自錢存柔、黃儀秀. 微生物學實驗教程. 北京：北京大學出版社. 1999）按管口及瓶口大小制作的棉塞，應緊貼管壁和瓶壁，不留縫隙，以防空氣中的微生物沿縫隙侵入。目前也有采用金屬或塑料試管帽代替棉塞，直接蓋在試管口上，滅菌待用。用10%NaOH調(diào)整pH。%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混勻后分裝于置有小玻璃倒管的試管內(nèi)，每管10mL，塞好棉塞、包扎。④伊紅美藍培養(yǎng)基：伊紅美藍瓊脂40 g，蒸餾水1000mL。（5）滅菌干熱滅菌法：培養(yǎng)皿、移液管、試管及其他玻璃器皿可用該法。微生物實驗所需的一切器皿、器具、培養(yǎng)基（不耐高溫者除外）都可用此法滅菌。通過調(diào)整熱源，維持壓力、溫度。④將滅菌后的培養(yǎng)基置于恒溫箱內(nèi)，保持37℃作無菌培養(yǎng)1～2d，若無細菌生長說明滅菌合格，放入冰箱或陰涼處備用。細菌總數(shù)（CFU）是指1mL水樣在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24h后所生長的細菌菌落的總數(shù)。大腸菌群是腸道最普遍存在和數(shù)量最多、且與多數(shù)腸道病原菌存活期相近、并易于培養(yǎng)、觀察的一群需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。（1）自來水的采集：將自來水龍頭用酒精燈火焰灼燒5~10分鐘滅菌，然后再放水流5分鐘，以排除管道內(nèi)的存水，再用無菌容器取水。采樣器外部是一金屬框，內(nèi)裝玻璃瓶，器底有沉墜，可按需要墜入一定的深度，瓶蓋系有繩索控制瓶蓋啟閉，拉起繩索即打開瓶蓋裝水，松放繩索即自行蓋上。 采樣器（引自李軍、：）水樣采集后，迅速送回實驗室進行檢驗。 細菌總數(shù)的測定（1）自來水的測定用1mL無菌移液管吸取1mL水樣，以無菌操作方式注入無菌培養(yǎng)皿中。冷卻凝固后，將以上所有平板倒置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)24h，計菌落數(shù)。取1mL水樣注入第一管9mL滅菌水內(nèi)，搖勻；再從第一管中取1mL水至第二管，搖勻；如此稀釋到第三管，則稀釋度分別為1010103。接種培養(yǎng)：用無菌移液管吸取三個適宜濃度的稀釋液1mL分別加入無菌培養(yǎng)皿中，每一稀釋度做2個平行，共6個。有以下幾種情況：①首先選擇平均菌落數(shù)在30~300之間者進行計算。④若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（）。若片狀菌落約為平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均勻，則可按半平板上的菌落計數(shù)，然后乘以2作為整個平板的菌落數(shù)。 稀釋度選擇及菌落總數(shù)報告方式例次不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個稀釋度菌落數(shù)之比菌落總數(shù)(個/mL)報告方式(個/mL)1011021031136516420—164001042276029546377501043289027160271001044無法計數(shù)4650513—513000105527115—2701026無法計數(shù)30512—305001047無法計數(shù)無法計數(shù)無法計數(shù)—103無法計數(shù) 大腸菌群的測定大腸菌群數(shù)的檢驗方法多采用多管發(fā)酵法，包括初(步)發(fā)酵試驗、平板分離和復發(fā)酵試驗三個部分。若培養(yǎng)基顏色不變（仍為紅色），但小倒管中有氣體產(chǎn)生，溶液不渾濁，則是操作問題，應重做實驗。平板劃線方法：先將接種環(huán)放在灑精燈火焰上灼燒滅菌，然后以無菌操作，用接種環(huán)醮取初發(fā)酵呈陽性反應試管中的菌液。③復發(fā)酵實驗經(jīng)涂片、染色、鏡檢，如為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，則挑取該菌落的另一部分，重新接種于單倍濃度乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，每管可接種來自同一初發(fā)酵管的同類型菌落1~3個，37℃培養(yǎng)24h，結(jié)果若產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，即證實有大腸菌群存在。以下步驟同上述自來水的平板分離和復發(fā)酵試驗。 大腸菌群檢數(shù)表()接 種 水 樣 量/mL每升水樣中大腸菌群數(shù)101－－－－90－－－＋90－－＋－90－＋－－95－－＋＋180－＋－＋190－＋＋－220＋－－－230－＋＋＋280＋－－＋920＋－＋－940＋－＋＋1800＋＋－－2300＋＋－＋9600＋＋＋－23800＋＋＋＋23800“＋”發(fā)酵陽