【正文】 位，染色約1min。接種環(huán)用后必須再次燒灼滅菌。（4）95％乙醇（5）番紅染液：%番紅的乙醇溶液10mL，蒸餾水100mL混合過(guò)濾。應(yīng)用新鮮幼齡的菌體進(jìn)行涂片。根據(jù)細(xì)菌對(duì)此種染色法的反應(yīng)不同，可將細(xì)菌分為兩大類，菌體呈者為革蘭氏陽(yáng)性菌，呈紅色者為革蘭氏陰性菌。 簡(jiǎn)單染色法利用細(xì)菌在中性環(huán)境中帶負(fù)電荷，而堿性染料如結(jié)晶紫、美藍(lán)、堿性復(fù)紅、番紅等解離后帶正電荷，細(xì)菌與染料具有親和力而被著色的原理，采用一種單色染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，稱為簡(jiǎn)單染色法。顯微鏡的金屬油漆部件和塑料部件，可用軟布沾中性洗滌劑進(jìn)行擦拭，不要使用有機(jī)溶劑。粗、細(xì)調(diào)節(jié)螺旋、聚光器螺旋和標(biāo)本移動(dòng)器等機(jī)械部分要靈活而不松動(dòng)，如不靈活可在滑動(dòng)部位滴加少許潤(rùn)滑油。不使用時(shí)，用有機(jī)玻璃或塑料布防塵罩罩起來(lái)。用擦鏡紙清潔其它物鏡及目鏡；用綢布清潔顯微鏡的金屬部件。另外應(yīng)特別注意，不要因在下降鏡頭時(shí)或提升載物臺(tái)時(shí)用力過(guò)猛或調(diào)焦時(shí)誤將粗調(diào)節(jié)器向反方面轉(zhuǎn)動(dòng)而損壞鏡頭及載玻片。對(duì)于不等焦的顯微鏡，用粗調(diào)節(jié)器下降載物臺(tái)或升高鏡筒，使物鏡逐漸遠(yuǎn)離玻片，在標(biāo)本觀察區(qū)滴加鏡油，然后將油鏡轉(zhuǎn)至鏡筒下方，須在側(cè)面注視下，用粗調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)上升載物臺(tái)或下降鏡筒，使物鏡與玻片接近，將油鏡前端浸入鏡油中，并幾乎與標(biāo)本相接。適當(dāng)調(diào)節(jié)聚光器光圈及視野亮度，用細(xì)調(diào)節(jié)器使物像清晰，利用推進(jìn)器移動(dòng)標(biāo)本，仔細(xì)觀察并記錄所觀察到的結(jié)果。如有內(nèi)置光源燈可通過(guò)調(diào)節(jié)電壓以獲得適當(dāng)?shù)恼彰髁炼取＃?） 標(biāo)本放置下降載物臺(tái)或升高鏡筒，使物鏡遠(yuǎn)離載物臺(tái)。其強(qiáng)弱可進(jìn)行調(diào)節(jié)。虹彩光圈附于聚光器內(nèi)部，可開大或縮小，以調(diào)節(jié)進(jìn)入鏡頭的光線的強(qiáng)弱。目鏡是把接物鏡放大的實(shí)像再放大一次，并把物像映入觀察者的眼中。物鏡轉(zhuǎn)換器安裝在鏡筒的下端，其上裝有3～4個(gè)不同放大倍數(shù)的物鏡，可以通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器選用合適的物鏡。鏡筒上端插入目鏡，下端與物鏡轉(zhuǎn)換器相接。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)普通光學(xué)顯微鏡由機(jī)械和光學(xué)兩大部分組成。 器材和材料 儀器或其它用具光學(xué)顯微鏡、鏡紙、吸水紙等。 溶劑或試劑⑴鏡油：香柏油或石蠟油。 顯微鏡構(gòu)造示意圖1. 目鏡；2. 鏡筒；3. 鏡臂；4. 標(biāo)本移動(dòng)器；5. 粗動(dòng)限位器；6. 粗調(diào)節(jié)器；7. 細(xì)調(diào)節(jié)器；8. 鏡座；9. 反光鏡；10. 虹彩光圈；11. 聚光器；12. 載物臺(tái)；13. 物鏡；14. 物鏡轉(zhuǎn)換器（引自錢存柔、黃儀秀. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程. 北京：北京大學(xué)出版社. 1999）⑴機(jī)械部分鏡座是顯微鏡的基座，使顯微鏡能平穩(wěn)地放置在桌子上。載物臺(tái)是放置標(biāo)本的地方。調(diào)節(jié)器安裝在鏡臂的基部，是調(diào)節(jié)物鏡與被檢標(biāo)本之間距離的裝置，通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器和細(xì)調(diào)節(jié)器便可清晰地觀察到標(biāo)本。通常有10等規(guī)格。光圈大小應(yīng)適當(dāng)，使物像能得到更清晰的效果。 顯微鏡的使用方法（1） 顯微鏡的取用和放置從顯微鏡箱或柜內(nèi)取出顯微鏡時(shí)，應(yīng)一手提鏡臂，另一手托鏡座，讓顯微鏡直立，防止目鏡從鏡筒中脫落。將低倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，把標(biāo)本玻片置于載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)推進(jìn)器使觀察對(duì)象處在物鏡的正下方。再由目鏡觀察，同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器下降載物臺(tái)或升高鏡筒，使物鏡逐漸遠(yuǎn)離玻片，標(biāo)本在視野中顯現(xiàn)后，再使用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)至圖像清晰。在一般情況下，當(dāng)物像在一種物鏡中已清晰聚焦后，轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器將其他物鏡轉(zhuǎn)到工作位置進(jìn)行觀察時(shí)，物像將保持基本準(zhǔn)焦?fàn)顟B(tài)，這種現(xiàn)象稱為物鏡的同焦。將聚光器升到最高位置并開足光圈，調(diào)節(jié)照明，使視野的亮度合適，用粗調(diào)節(jié)器上升鏡筒或下降載物臺(tái)，使物鏡緩慢離開玻片，直至視野中出現(xiàn)物像，并用細(xì)調(diào)節(jié)器使其清晰準(zhǔn)焦為止。（6） 顯微鏡用畢后的處理用粗調(diào)節(jié)器使物鏡遠(yuǎn)離玻片，取下載玻片。放平反光鏡，把聚光鏡降下，將物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，將各部分還原，歸置鏡箱中。也可套上布罩后放入顯微鏡箱內(nèi)或顯微鏡柜內(nèi)，并在箱或柜內(nèi)放置干燥劑。（4） 顯微鏡的目鏡、物鏡、聚光器和反光鏡等光學(xué)部件必須保持清潔，防止長(zhǎng)霉。（5） 用油鏡觀察后，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后用擦鏡紙沾少許鏡頭清洗液擦拭，最后用干凈的擦鏡紙擦干。適用于菌體一般形態(tài)的觀察。其原因是由于這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。 試劑及染液（1）齊氏石炭酸復(fù)紅染液：A液：，95%乙醇10mLB液：，蒸餾水95mL將A、B二液混合搖勻過(guò)濾。 器材無(wú)菌水、顯微鏡、擦鏡紙、吸水紙、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、石蠟油、鏡頭清洗液。干燥 涂布后，待其在空氣中自然晾干。（3）水洗斜置載玻片，傾去染液，用細(xì)水流輕輕沖去多余染料，直至流水變清為止。注意各種細(xì)菌的形態(tài)和細(xì)胞排列方式。方法與簡(jiǎn)單染色相同。脫色 用濾紙吸去玻片上的殘水，乙醇滴加在涂片上靜置30S立即水洗。復(fù)染 滴加番紅復(fù)染1min后水洗并干燥。若研究工作中要確定未知菌的革蘭氏反應(yīng)時(shí)，則需同時(shí)用已知菌進(jìn)行染色作為對(duì)照。但一般培養(yǎng)基的配制程序及其他的準(zhǔn)備工作卻大致相同，例如器皿的準(zhǔn)備、培養(yǎng)基的配制和分裝、棉塞的制作、培養(yǎng)基的滅菌、斜面與平板的制作以及培養(yǎng)基的無(wú)菌檢查等基本環(huán)節(jié)大致相同。（3）玻璃器皿：培養(yǎng)皿、試管、150mL大試管、移液管（1mL和10mL）、錐形瓶（250mL、500mL）、1000mL燒杯、量筒、玻璃漏斗等。培養(yǎng)皿、試管、錐形瓶等較大的器皿可用洗衣粉或去污粉洗滌，并用清水沖洗干凈；移液管先用洗液浸泡，再用清水沖洗干凈。②移液管的包裝：用細(xì)鐵絲將少許棉花塞入移液管的吸端，~（避免外界及口中雜菌吸入管內(nèi)，防止菌液等吸入口中）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需，可單支也可多支包裝。 棉塞制作過(guò)程（引自錢存柔、黃儀秀. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程. 北京：北京大學(xué)出版社. 1999）按管口及瓶口大小制作的棉塞，應(yīng)緊貼管壁和瓶壁，不留縫隙，以防空氣中的微生物沿縫隙侵入。目前也有采用金屬或塑料試管帽代替棉塞，直接蓋在試管口上，滅菌待用。用10%NaOH調(diào)整pH。%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混勻后分裝于置有小玻璃倒管的試管內(nèi)，每管10mL，塞好棉塞、包扎。④伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基：伊紅美藍(lán)瓊脂40 g，蒸餾水1000mL。（5）滅菌干熱滅菌法：培養(yǎng)皿、移液管、試管及其他玻璃器皿可用該法。微生物實(shí)驗(yàn)所需的一切器皿、器具、培養(yǎng)基（不耐高溫者除外）都可用此法滅菌。通過(guò)調(diào)整熱源，維持壓力、溫度。④將滅菌后的培養(yǎng)基置于恒溫箱內(nèi)，保持37℃作無(wú)菌培養(yǎng)1～2d，若無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)說(shuō)明滅菌合格，放入冰箱或陰涼處備用。細(xì)菌總數(shù)（CFU）是指1mL水樣在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24h后所生長(zhǎng)的細(xì)菌菌落的總數(shù)。大腸菌群是腸道最普遍存在和數(shù)量最多、且與多數(shù)腸道病原菌存活期相近、并易于培養(yǎng)、觀察的一群需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。（1）自來(lái)水的采集：將自來(lái)水龍頭用酒精燈火焰灼燒5~10分鐘滅菌，然后再放水流5分鐘，以排除管道內(nèi)的存水，再用無(wú)菌容器取水。采樣器外部是一金屬框，內(nèi)裝玻璃瓶，器底有沉墜，可按需要墜入一定的深度，瓶蓋系有繩索控制瓶蓋啟閉，拉起繩索即打開瓶蓋裝水，松放繩索即自行蓋上。 采樣器（引自李軍、：）水樣采集后，迅速送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢驗(yàn)。 細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定（1）自來(lái)水的測(cè)定用1mL無(wú)菌移液管吸取1mL水樣，以無(wú)菌操作方式注入無(wú)菌培養(yǎng)皿中。冷卻凝固后，將以上所有平板倒置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)24h，計(jì)菌落數(shù)。取1mL水樣注入第一管9mL滅菌水內(nèi)，搖勻；再?gòu)牡谝还苤腥?mL水至第二管，搖勻；如此稀釋到第三管，則稀釋度分別為1010103。接種培養(yǎng)：用無(wú)菌移液管吸取三個(gè)適宜濃度的稀釋液1mL分別加入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每一稀釋度做2個(gè)平行，共6個(gè)。有以下幾種情況：①首先選擇平均菌落數(shù)在30~300之間者進(jìn)行計(jì)算。④若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（）。若片狀菌落約為平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均勻，則可按半平板上的菌落計(jì)數(shù)，然后乘以2作為整個(gè)平板的菌落數(shù)。 稀釋度選擇及菌落總數(shù)報(bào)告方式例次不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個(gè)稀釋度菌落數(shù)之比菌落總數(shù)(個(gè)/mL)報(bào)告方式(個(gè)/mL)1011021031136516420—164001042276029546377501043289027160271001044無(wú)法計(jì)數(shù)4650513—513000105527115—2701026無(wú)法計(jì)數(shù)30512—305001047無(wú)法計(jì)數(shù)無(wú)法計(jì)數(shù)無(wú)法計(jì)數(shù)—103無(wú)法計(jì)數(shù) 大腸菌群的測(cè)定大腸菌群數(shù)的檢驗(yàn)方法多采用多管發(fā)酵法，包括初(步)發(fā)酵試驗(yàn)、平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)三個(gè)部分。若培養(yǎng)基顏色不變（仍為紅色），但小倒管中有氣體產(chǎn)生，溶液不渾濁，則是操作問(wèn)題，應(yīng)重做實(shí)驗(yàn)。平板劃線方法：先將接種環(huán)放在灑精燈火焰上灼燒滅菌，然后以無(wú)菌操作，用接種環(huán)醮取初發(fā)酵呈陽(yáng)性反應(yīng)試管中的菌液。③復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)經(jīng)涂片、染色、鏡檢，如為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，則挑取該菌落的另一部分，重新接種于單倍濃度乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，每管可接種來(lái)自同一初發(fā)酵管的同類型菌落1~3個(gè)，37℃培養(yǎng)24h，結(jié)果若產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，即證實(shí)有大腸菌群存在。以下步驟同上述自來(lái)水的平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。 大腸菌群檢數(shù)表()接 種 水 樣 量/mL每升水樣中大腸菌群數(shù)101－－－－90－－－＋90－－＋－90－＋－－95－－＋＋180－＋－＋190－＋＋－220＋－－－230－＋＋＋280＋－－＋920＋－＋－940＋－＋＋1800＋＋－－2300＋＋－＋9600＋＋＋－23800＋＋＋＋23800“＋”發(fā)酵陽(yáng)