【正文】 體結(jié)合特性以及CTB的抗原性。因此，本實驗中所使用的15bp多角體同源序列可被用作為一個結(jié)構(gòu)元件，在多角體啟動子下游促進外源基因的高效表達。為了提高融合基因CTBINS在家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達水平，我們同時開展了部分多角體同源序列對外源基因在桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達的影響分析。非肥胖性糖尿病（NOD）小鼠經(jīng)口服含微克級的CTB與胰島素融合蛋白的蠶血淋巴，病理組織切片實驗表明胰島發(fā)炎程度顯著減輕。在體內(nèi)成功誘導(dǎo)免疫耐受需要長期口服大量的蛋白抗原， CTB可作為誘導(dǎo)口服耐受的強大粘膜運載系統(tǒng)，自身抗原通過與CTB蛋白偶聯(lián)可極大地較少口服自身抗原的劑量。(3) 糖尿病基因工程口服疫苗的制備及其對I型糖尿病的治療研究由于家蠶生物反應(yīng)器表達蛋白進行翻譯后修飾，其表達產(chǎn)物生物活性可以和天然蛋白相媲美，我們開展了口服家蠶表達霍亂毒素B亞基（CTB）與胰島素融合蛋白對治療自身免疫性糖尿病的研究。5個劑量組27名受試者單次口服150～900μg的rhGMCSF膠囊的一般檢查、血生化、血液學(xué)、尿液和心電圖檢查結(jié)果用藥前后均無具臨床意義的改變，無藥物不良反應(yīng)發(fā)生。為了研究家蠶生物反應(yīng)器表達的BmrhGMCSF在人體內(nèi)的口服吸收利用度，我們以每100mg蠶蛹粉中含12181。109cells/L，遠遠高于陰性對照組的狗。動物試驗表明，口服BmrhGMCSF15分鐘后，可以在老鼠的血液中檢測到20kDa125I標(biāo)記的BmrhGMCSF蛋白片段。和其他方法相比，該方法純化蛋白的得率提高了大約40％。相關(guān)研究成果發(fā)表在J. 。我們通過重組家蠶桿狀病毒在家蠶蛹中成功表達了人粒細(xì)胞巨細(xì)胞激落刺激因子（hGMCSF）。BmBacPAK6用作載體表達人EPO基因，感染家蠶蟲體和家蠶蛹時，104U/ml血淋巴；在此基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建半胱氨酸蛋白酶缺失型BmNPV基因工程載體，通過一種半胱氨酸蛋白酶基因缺失型家蠶核多角體病毒BmZJCP基因組DNA和構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體pCPGFP與上述BmBacPAK6共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)同源重組獲得。這類藥物既可以免去藥物的分離純化過程，又可解除病人注射的痛苦和被感染的危險。在國內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表研究論文170余篇，其中被SCI收錄 40余篇，編寫專著6本；完成科研項目26項，其中國家級13項，省部級10項，在研項目4項；獲得國家發(fā)明專利14項，公開國家發(fā)明專利5項；在國際學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表研究論文37篇；申請國家發(fā)明專利17項，獲得國家發(fā)明專利7項。我們在國際上首次克隆家蠶桿狀病毒（BmNPV）的P10基因并證明P10啟動子也是強啟動子，具備作為表達載體啟動子的功能特征，首次利用BmNPV P10啟動子在家蠶細(xì)胞中表達了氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶。成功構(gòu)建重組可救活線性化家蠶核多角體病毒基因工程載體，篩選效率提高1000倍，時間縮短10倍；成功構(gòu)建半胱氨酸蛋白缺失型家蠶核多角體病毒基因工程載體，表達效率提高40%。在家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服藥物和疫苗的研究、家蠶功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)以及家蠶RNA相關(guān)研究中都取得了新的突破。(1) 家蠶生物反應(yīng)器蛋白高效表達技術(shù)平臺的構(gòu)建國際上首次克隆并測序家蠶桿狀病毒（BmNPV）的P10基因（GenBank 登錄號為S76783），并證明P10啟動子也是強啟動子，具備作為表達載體啟動子的功能特征，此后，首次利用P10啟動子在家蠶細(xì)胞中表達了氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶；通過野生型家蠶核多角體病毒中國鎮(zhèn)江株BmNPV ZJ8基因組與修飾型苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒AcNPV BacPAK6基因組在家蠶細(xì)胞內(nèi)同源重組，構(gòu)建成重組救活可線性化修飾型家蠶核多角體病毒基因工程載體BmBacPAK6。此半胱氨酸蛋白酶缺失型病毒感染的家蠶細(xì)胞中，外源基因表達量比對照高約40％，宿主存活期及產(chǎn)物高表達期延長，從而提高總表達量。表達的重組蛋白rhGMCSF分子量為29kDa，脫糖基化分析表明和大腸桿菌表達rhGMCSF相比，家蠶蛹表達rhGMCSF經(jīng)過了糖基化后修飾，同時還可能經(jīng)過了其他的翻譯后修飾。我們通過家蠶蛹生物反應(yīng)器高效表達了rhGMCSF，為了進一步研究家蠶蛹所表達的rhGMCSF藥效功能，從家蠶蛹中大規(guī)模純化重組蛋白成為一個較大的挑戰(zhàn)。相關(guān)研究成果發(fā)表在Appl. Biochem. 。免疫組化試驗顯示可以在老鼠腸的組織細(xì)胞中檢測到BmrhGMCSF。同時骨髓涂片試驗表明，口服BmrhGMCSF動物的白細(xì)胞中肌胚細(xì)胞和前顆粒性細(xì)胞所占百分比遠遠高于陰性對照組動物。g的BmrhGMCSF制成膠囊，根據(jù)雙處理、雙周期、兩序列的隨機交叉試驗設(shè)計方法，選擇21例志愿者，口服BmrhGMCSF8181。18例惡性腫瘤患者在化療結(jié)束24小時后開始口服BmrhGMCSF膠囊相對安慰劑組能明顯減慢或阻止白細(xì)胞下降。I型糖尿病由胰島素分泌缺陷產(chǎn)生，它是一種針對胰島β細(xì)胞的自身免疫性疫病。這些都暗示CTB偶聯(lián)自身抗原不僅使口服耐受防治I型糖尿病等自身免疫性疫病更具有實際應(yīng)用價值，而且還有潛在的治療前景。適時監(jiān)測血糖的實驗結(jié)果亦表明糖尿病的病理癥狀得到明顯延緩，過繼轉(zhuǎn)移實驗亦表明口服該融合蛋白產(chǎn)生了潛在的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞從而抑制糖尿病的發(fā)生。本研究在融合基因CTBINS的5’端融合了部分來自多角體基因的5’非編碼區(qū)（ATAAAT）和編碼區(qū)（ATGCCGAAT）共15bp的核酸序列，因此與原CTBINS融合蛋白相比，經(jīng)過修飾的融合蛋白（mCTBINS）在其N末端增加了兩個氨基酸ProAsn。相關(guān)研究成果發(fā)表在Biotech. Appl. 。非肥胖性糖尿病小鼠經(jīng)口服含微克級的CTB與胰島素B鏈融合蛋白的蠶血淋巴，病理組織切片實驗表明小鼠胰島發(fā)炎程度顯著減輕。(4) 家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)其他口服藥物和疫苗的研究我們同時還開展了其他許多重要藥用蛋白和疫苗的表達和口服研究工作。（ii）家蠶表達人乳鐵蛋白生產(chǎn)口服治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物研究我們獲得了在蠶體中能高效表達人乳鐵蛋白（hLf）基因的重組家蠶桿狀病毒，在家蠶中表達量高達192 μg/ml蠶血淋巴。結(jié)果表明利用重組hLf治療潰瘍性結(jié)腸炎，反映臨床表現(xiàn)的DAI和組織學(xué)得到改善，髓過氧化物酶（MPO）明顯降低，有效的緩解硫酸葡聚糖鈉（DSS）誘導(dǎo)的潰瘍性急性結(jié)腸炎，為進一步進入臨床，生產(chǎn)口服治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物打下理論基礎(chǔ)。對小鼠每天腹腔注射一次含重組蛋白的蠶血淋巴。雖然劑量要求比注射方式要重些，但從時間來看，效果比后者持續(xù)的更久些。相關(guān)研究成果發(fā)表在Acta Biochim. . 。ELISA 檢測表明在家蠶幼蟲和蛹中，感染重組病毒后第四天hEGF蛋白表達量達到最大。相關(guān)研究成果發(fā)表在African J. 。（vii）蠶表達丙肝抗原制備治療和抗丙型肝炎口服藥物的研究用蠶表達的丙型肝炎（HCV）的C+E1基因產(chǎn)物，可以應(yīng)用HCV抗體的檢測，用蠶表達的HCV的C+E1基因產(chǎn)物，經(jīng)過劑型研制，進行動物口服試驗，通過三百只老鼠的試驗，口服組的HCV抗體陽性率超過到95%以上，為口服疫苗的研制提供依據(jù)。同時，桿狀病毒表面展示系統(tǒng)能夠完成翻譯后蛋白質(zhì)的加工修飾，使外源產(chǎn)物具有較高生物學(xué)活性。將重組桿狀病毒接種蠶蛹后56天收獲蠶蛹，經(jīng)過多步離心、超速離心、區(qū)帶離心、超濾等方法收獲重組桿狀病毒。病毒分離、RTPCR結(jié)果顯示重組疫苗可能有抵御病毒攻擊的作用。攻毒后第2天高、中、低劑量組分別有1只動物中和抗體達到1：4，攻毒后第5天高、低劑量組各有1只動物中和抗體達到1：4，攻毒后第7天高、中、低劑量組分別有1只動物中和抗體達到1：8，攻毒后第14天高、中、低劑量組分別有1只動物中和抗體達到1：16。試驗結(jié)果表明疫苗組的高、中劑量組有抵御病毒攻擊的作用。對猴心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和體溫也無明顯影響。次）、%NaCl注射液 1 ml/（kg（e）禽流感疫苗大鼠長期毒性試驗SD大鼠連續(xù)八次皮下注射給予批號為200610020061201的禽流感疫苗，對大鼠的主要毒副反應(yīng)為注射部位出現(xiàn)肉芽腫樣結(jié)節(jié)但停藥有逐漸縮小的趨勢，個別血液學(xué)指標(biāo)（Grn↑，MCV↓）和臟器的重量及系數(shù)（肝臟系數(shù)、脾臟重量及系數(shù)↑）的升降影響。（f）禽流感疫苗豚鼠全身主動過敏試驗資料健康白色豚鼠分別皮下注射禽流感疫苗 1700μg、340μg/()，牛血清白蛋白生理鹽水溶液60mg（2ml）/（）和溶媒2ml/（）劑量，隔日一次，連續(xù)3次進行致敏。目前疫苗I期臨床試驗正在開展中。此重組病毒感染家蠶蛹體72小時，獲得融合蛋白可展示于囊膜病毒囊膜表面的重組病毒。在重組病毒感染細(xì)胞后期112小時，細(xì)胞膜由于病毒大量出芽而破碎，但破碎的膜上仍帶有大量的HA融合蛋白。基于出芽病毒并將標(biāo)記蛋白展示宿主細(xì)胞表面，通過病毒出芽，將宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜剝離于細(xì)胞而獲得純的膜結(jié)構(gòu)達到分離獲得膜蛋白的目的，特別適合分離低豐度膜蛋白?？梢赃_到同時把細(xì)胞的膜蛋白和囊泡等膜蛋白分離的目的，對推動膜蛋白組學(xué)的研究增添了新的手段和技術(shù)。這種新的表達系統(tǒng)可獲得更多的重組目的蛋白，因為多角體蛋白基因序列保留越多，則表達水平越接近天然多角體蛋白的表達水平（3050%），因而目的蛋白的表達量可超過5%。通過cDNA文庫的構(gòu)建，我們發(fā)現(xiàn)大量蛹期表達的功能基因，對其中部分功能基因進行了表達，抗體制備和功能研究，為進一步研究這些功能基因在家蠶生長發(fā)育調(diào)控中的作用打下基礎(chǔ)。維甲酸是一種重要的信號分子，能通過調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄、表達，誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡。我們用不同量的dsRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，atRA處理后用MTT試驗檢測細(xì)胞的活力，以此確定了最佳轉(zhuǎn)染條件。這些數(shù)據(jù)表明，在家蠶中維甲酸結(jié)合蛋白的主要功能是影響atRA對細(xì)胞的生長抑制作用。通過Western blotting和免疫熒光法分析了兩種1433蛋白的亞細(xì)胞定位，Bm1433ζ蛋白既存在于細(xì)胞質(zhì)中也存在細(xì)胞核中，而Bm1433ε蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)中。（d）家蠶肌鈣蛋白C基因的研究肌鈣蛋白C（Troponin C, TnC）是一種EF手圖形超家族蛋白，可以結(jié)合Ca2+并發(fā)揮其生物學(xué)功能。通過免疫組織化學(xué)實驗，我們也發(fā)現(xiàn)該蛋白主要分布在家蠶五齡幼蟲的表皮、氣門、腸道、馬氏管、頭部等組織中，以及蛹的頭部、腸道、體壁等組織中。相關(guān)研究成果發(fā)表在Cell Tissue 。熒光定量PCR結(jié)果顯示BmPFN蛋白在各組織中絲腺表達量最高，生殖器表達量次之，脂肪體中的表達量最低；在卵、幼蟲、蛹和蛾四個發(fā)育時期中，幼蟲的表達量最高，蛹次之，蛾中較少，卵中表達量最少；同時Western blotting結(jié)果顯示BmPFN在蛹期表達最高，mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平存在一定的差異，該蛋白可能存在翻譯水平的調(diào)控，如microRNA對蛋白表達調(diào)控，生物信息學(xué)分析也表明該基因mRNA存在9個microRNA結(jié)合位點，正在進行進一步的試驗驗證。RNA中的這些甲基化修飾主要是通過SadenosylLmethionone（AdoMet）依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶(MTase)來催化的。我們還合成了BmRNAMTase的dsRNA，并轉(zhuǎn)染了家蠶細(xì)胞Bm5，通過MTT法測細(xì)胞活性，實驗結(jié)果表明， μg/ml、干擾72h后細(xì)胞活性明顯降低。（g）家蠶中一個新Kazal型蛋白酶抑制劑的表達、定位及其功能研究Kazal型蛋白酶抑制劑廣泛存在于生物體內(nèi)，對機體的發(fā)育和免疫應(yīng)答等生理過程發(fā)揮極其重要的作用。提取五齡蠶的各個組織和各個時期（卵，幼蟲，蛹，蛾）的總RNA，進一步用熒光相對定量PCR檢測表明BmSPI在表皮中表達量最高，脂肪體中表達量最低，在幼蟲期中表達量最高，在卵期表達量最低。該上樣方式改進了傳統(tǒng)的上樣技術(shù)，采用八孔道加樣器和獨特的上樣程序減小了蛋白樣品的損失。我們改進的上樣方式通過采用八孔道加樣器，先將水化液轉(zhuǎn)移到膠條槽內(nèi)，再將樣品以均勻滴加的方式分布在水化液滴上，在重漲膠條過程中施加電壓。12）；同時，八孔道加樣器使用簡單和可確保實驗的重復(fù)性。樣品的制備無疑是蛋白質(zhì)組學(xué)2DE電泳分離最為重要和關(guān)鍵的一步。采用該制備方法獲得了據(jù)我們所知迄今為止分離蠶卵樣品最多點的蛋白質(zhì)組圖譜，這將有利于更多生物相關(guān)蛋白的發(fā)現(xiàn)以及鑒定，為構(gòu)建較完善的蠶卵蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)組學(xué)方法學(xué)應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)。實驗結(jié)果表明高溫激變方法可獲取較滿意的無性繁殖發(fā)育卵和孵殖率；并且高溫刺激方法獲得的孵化率在一定時間范圍內(nèi)隨著卵齡的增加孵化率有所提高。通過蛋白質(zhì)組生物信息學(xué)的功能分析，發(fā)現(xiàn)一些重要相關(guān)蛋白質(zhì)，涉及了細(xì)胞骨架蛋白，HSP蛋白家族以及與細(xì)胞周期，凋亡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)蛋白質(zhì)，這些差異表達的蛋白質(zhì)可能通過不同途徑參與了家蠶孤雌生殖的發(fā)育過程并發(fā)揮著不同的功能。我們通過果蠅Yellow基因序列進行blast比對分析獲得家蠶Yellow基因的EST序列，然后通過RACE法得到家蠶Yellow蛋白家族成員全長cDNA序列，該蛋白家族包含存在MRJP域和信號肽的7個成員。相關(guān)研究成果發(fā)表在BMC Genomics上。家蠶基因組草圖預(yù)測得到的蛋白庫，共14,632 潛在蛋白；第二個蛋白庫為從我們構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫得到的蛋白庫，共4,074個30個aa以上的潛在蛋白；第三個蛋白庫為UniProt蛋白庫中下載的家蠶蛋白，共2111個蛋白。這些研究為家蠶蛋白的表達和功能分析打下基礎(chǔ)。鑒定出的新的小RNA命名為bmomiR100like ，它是以miRNA agamiR100為探針，采用生物芯片和Northern blotting鑒定出，但是其前體序列不能折疊為miRNA前體常見的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。進一步，我們發(fā)現(xiàn)在Northern blotting中，用來檢測miRNA的DNA探針甲基化能夠提高探針檢測的靈敏度。在預(yù)測的miRNA靶基因中，有61個基因存在多個靶位點，這61個預(yù)測的靶基因應(yīng)該作為將來功能研究的首選基因。A to I RNA編輯作為一種遺傳基因重編碼能夠改變蛋白序列高度保守的編碼區(qū)域。我們不僅闡明了A to I RNA 編輯在進化上可需要性的機制，同時證明怎樣預(yù)測核A to I 編輯位點，在這些編輯位點中，RNA編輯發(fā)生將維持蛋白在相近物種中的保守性。我們分析了不同昆蟲3億多年進化過程中Kv2 K+通道蛋白基因的A to I 編輯情況，這些昆蟲包括：Drosophila melanog