【正文】 的，不過如果不能達到我上面說的那種情況，這所謂的“分開”對實驗有什么意義嗎？和分不開有什么區(qū)別嗎？【2】哈，應(yīng)該注意適度原則，“度”很重要，有些時候不是越大越好，要注意適度。謝謝！答：【1】哈，不好意思，我把“分開”的意思理解錯了。所以，估計和蛋白抗體等也有關(guān)系，但可能并不是主要的原因。【4】夾膜用的鑷子一定要干凈，每次用它夾膜之前，一般可以先在液體里（比如應(yīng)用中的TBST等液體）過一下（洗一下，就是在液體里搖一下），鑷子不干凈很容易導致熒光淬滅的?！?】熒光可能對一些物質(zhì)敏感，導致熒光淬滅。有些戰(zhàn)友提到用鑷子碰到膜會導致熒光淬滅，可能是因為鑷子是金屬的緣故。如果膠片上沒有條帶，可以適當延長曝光時間?！?】要知道ECL的敏感性要比麗春紅強很多的，也就是說比麗春紅敏感很多倍的，染色染不出的蛋白，顯色或者曝光照樣可以出條帶的。而是看膠上是否有蛋白，是否有比較清楚的蛋白條帶?！?】很多人都在考馬斯蘭染色的膠上或者在麗春紅染色的膜上找自己的目的條帶，看到一個條帶就說是自己的目的條帶?？墒寝D(zhuǎn)膜后就真的什么都看不到了似的。[7]請問有人做過19KD的蛋白嗎？已經(jīng)做了一段時間了，可是還是沒有什么起色啊?！?】增加顯色時間?！?】感覺還是用試劑盒好一些。有什么提取方法比較好！。（把膜拿到暗室觀察什么都沒有，只有一些熒光液的殘留痕跡，成隱約大片狀，多出現(xiàn)于膜的邊緣處，絕對不成條帶狀。6，TBS/T洗膜3次，每次10分鐘。）4，TBS/T洗膜3次，每次5分鐘，搖床上。放在4度冰箱過夜。一般來說，2小時也可以的，但是1小時有些短了）。【5】我把你的步驟改了一下。如果膜放到顯色液里，熒光很弱，可以多放一會，其實不用放很長時間也是可以的?！?】整個顯色曝光都應(yīng)該在暗室里呀。8，曝光5分鐘，顯影（至今為出現(xiàn)目的條帶），定影。室溫搖床2小時。先室溫搖床上1小時，再放在4度冰箱過夜。但是我始終做不出結(jié)果，現(xiàn)把步棸詳解如下，希望大家?guī)臀曳治鲆幌拢?，封閉（5％的脫脂奶粉）一小時，室溫下?lián)u床上進行。當然轉(zhuǎn)膜很多條件都是可以的。答：【1】上樣量一般是20－100微克，你的上樣量是20微克，你的條帶很弱或者出不來，為什么不加大上樣量呢？可以加到100微克左右呀（這點其實挺重要的）。再用ECL 處理等等。的leilaliu wrote:這是我的操作步驟： 組織，加1ml裂解液（1 mol/l ,NaCl , TritonX100 , 蒸餾水至50ml，使用時加了100ug/ml的PMSF)，機械勻漿2分鐘，冰上裂解30分鐘，然后14000g 10分鐘離心，取上清液。也可以一直用80伏。轉(zhuǎn)移液注意最好現(xiàn)配先用，不要用很多次，這很重要，我一般應(yīng)用不超過兩次。而且染色后再往下做后面的結(jié)果會收到一定的影響。然后就可以往下做了?！?】我的染色方法是：轉(zhuǎn)膜完成后，取出膜在甲醇里泡1分鐘，然后在雙蒸水中過一下，放入麗春紅里染色，室溫，搖床上，時間是5－30分鐘。下面是一份麗春紅的說明書：、硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜浸沒在麗春紅染色液中，搖動35分鐘或更長時間，直至出現(xiàn)清晰條帶。我們這里的很多人基本上用 的都是PVDF膜，染膜用的都是麗春紅。如果玻璃板洗不干凈，很容易造成樓主所說的現(xiàn)象。我的配膠體系如下：15%分離膠 4%濃縮膠水 30%丙烯酰胺 TrisHCL 10%SDS 10%APS TEMED 我的蛋白分子量是11kd，濃縮膠60V,40min，分離膠90V，70min。跑膠時總是跑不直，呈拋物線型，請問是什么原因？我的試劑都是新配置的?！?】注意電泳液不要出問題（是否過期了，是否把轉(zhuǎn)移液當成電泳液了？），電泳液如果出問題，也會造成樓主所說的現(xiàn)象。大多數(shù)時候都能染出條帶的。對結(jié)果作適當 記錄。然后把染好的膜放到雙蒸水中洗一下，不要洗的太久，把表面的麗春紅洗掉就可以了?！?】麗春紅的染色敏感性和ECL敏感性差的很遠呢。所以，如果熟練了，后面就可以不染色了?！?】轉(zhuǎn)膜的時候，夾膠和膜的夾子的松緊要適中，可以通過調(diào)節(jié)濾紙的張數(shù)來控制夾子的松緊。也可以先用60伏，然后80伏。取20ug上樣量，然后80V濃縮膠，130V分離膠，然后80V，180mA轉(zhuǎn)膜2個小時，然后5%封閉一個小時，室溫。但是，我的目的蛋白：CaMKIIa總是做不出來?！?】你說：“80V，180mA轉(zhuǎn)膜2個小時”?！?】一抗孵育最好在搖床上，一抗孵育后，TBST清洗3次，每次5分鐘就可以了。2，TBS/T洗膜3次，每次5分鐘。4，TBS/T洗膜3次，每次5分鐘。6，TBS/T洗膜3次，每次5分鐘。（把膜拿到暗室觀察什么都沒有，只有一些熒光液的殘留痕跡，成隱約大片狀，多出現(xiàn)于膜的邊緣處，絕對不成條帶狀。你放外面顯色干什么呀？這是一個連續(xù)的過程，沒必要分開吧，感覺分開反而跟浪費時間呀?？梢园涯し诺奖ｕr膜上，因為保鮮膜上會粘有顯色液的，在保鮮膜上照樣可以進行顯色反應(yīng)的。供參考。2。（一抗孵育不是時間越長越好，應(yīng)該適度，如果越長越好，那直接在室溫或者在37度放一夜不是更好。（可以不用濾紙吸，直接放入二抗孵育）。（可以不用濾紙吸）。）[6] 本人在做一個18KD蛋白的wb，轉(zhuǎn)膜后預(yù)染marker各個條帶都可見，不知道就是目的條帶都不能曝光出來?！?】可以適當減少電泳的時間?！?】增加曝光時間，可以曝光很長時間的。現(xiàn)在跑膠倒是已經(jīng)可以了。有沒有什么辦法可以成功將量少的蛋白條帶轉(zhuǎn)膜?。梢钥隙ǖ恼f我的轉(zhuǎn)膜條件沒有將我所需要的條帶轉(zhuǎn)過）。其實真的是自己的目的條帶的可能性很小。染膜就是看蛋白是否轉(zhuǎn)到了膜上?！?】你的膜上都看到了蛋白，說明整體上還是可以的，可以繼續(xù)往下做?！?】用保鮮膜包好的帶熒光的膜，千萬不要放到金屬表面，碰到金屬表面，熒光會迅速的淬滅?！?】不注意的時候，把ECL的A和B混合了，以后再用，也會導致熒光淬滅。所以，盡量使和PVDF/NC膜接觸的物品（例如保鮮膜、洗膜用的培養(yǎng)皿等）都是干凈的。【5】熒光淬滅和蛋白抗體等也有原因。[9] 現(xiàn)需要將28Ku與26Ku的兩種蛋白通過跑SDSPAGE區(qū)分出來。我的理解中的“分開”是，可以用兩張小膜同時轉(zhuǎn)膜，然后28Ku與26Ku的兩種蛋白分別轉(zhuǎn)到這兩張膜上。其實二十幾的分子量用10％、12％?！?】分離膠的濃度和最佳分離范圍：（1）SDSPAGE分離膠濃度 －－－ 最佳分離范圍 （KD)6%膠 －－－－ －－－－－－－－50150 8%膠 －－－－ －－－－－－－－3090 10%膠 －－－－－－－－－－－－2080 12%膠 －－－－－－－－－－－－10－40 （2）分離膠濃度（％） －－－ 線性分離范圍（KD)15 －－－－－ －－－－－－ －－124310 －－－－ －－－－－－－－－1668 －－－－－－－－－－－－3694 －－－－ －－－－－－－ －57212【2】濃縮膠一般都是選4％或者5％下面是5％膠的配制方法：成分 配制不同體積SDSPAGE濃縮膠所需各成分的體積(毫升) 5%膠 － － 2 － － 3 － － 4 － － 6 － － 8 － － 10 蒸餾水 － － － － － － － － － － － － 30%AcrBis(29:1) － － － － － － － － － － － － 1M Tris, － － － － － － － － － － － － 10%SDS －－ －－ － － －－ － － － － 10%過硫酸銨 － － －－ － － － － －－－ － － TEMED － － －－ －－ － － － － － － 【3】哈，目標要明確，如果目標錯了，就不好了。[10]. 剛開始做western blot，走過兩遍完整的過程，可是結(jié)果很奇怪，請各位老師指導分析。和說明書上應(yīng)該出來的條帶差別很大，缺很多條帶，膠上主要缺56kd和43kd的條帶，請問這是怎么回事？小的那塊膜是我第一次做，用的是師兄流下來的試劑，大的一張改用同學的試劑（除了30％雙丙和10％sds），結(jié)果也還是一樣。ap 是現(xiàn)配的，temed 新買的，膠凝的很不錯。 答：【1】首先要注意電泳液的問題，是否過期？是否配錯了？看左邊的這張圖，即使最下面還有條帶，也會因為沒有膜了，而顯示不出來的?！?】其實制作MARKER的公司也是欠考慮的。即使同樣濃度的膠，其他條件也很難完全相同，所以，MARKER和說明中有一定的區(qū)別是可以理解的。【7】如果還不行，可以適當加大MARKER的上樣量，這樣跟容易找些。WB還真沒見到過紅色的圖片，長見識了?！?】上樣緩沖液中含有SDS。這樣就會出現(xiàn)條帶位置不一的情況。【4】配膠的時候，有些液體的PH值沒有調(diào)好[12]. 各位大俠,小弟是新手,最近在跑SDSPAGE電泳,可是電泳的mark有時跑得出來有時候跑不出來(7條帶0只跑出來3條或者4條),請各位指點一下,衷心感謝你答：你的分離膠是12％的，你看一下你的MARKER上的說明，看它怎么說的，一般都MARKER都會給出一個膠的范圍，說該MARKER適合什么樣的膠。而買的北京天根公司的預(yù)染MARKER 就比較差，條帶粗，比較分散，小分子的很容易跑散掉。和我一起做的現(xiàn)在用的是380毫安25分鐘（曾經(jīng)用過380毫安30分鐘，效果也挺好的），我們的分子量分別為42，46，47，105KD。我開始是把膜剪開的，分子量46的用380毫安25分鐘，105KD的用380毫安45分鐘，效果都挺好，但是分開轉(zhuǎn)有些麻煩。就拿我的105KD蛋白來說，380毫安轉(zhuǎn)25分鐘和45分鐘都可以。我轉(zhuǎn)膜時的降溫措施還是比較到位的，里面有冰槽，外面加冰袋?！?】我用的是ＢＩＯ－ＲＡＤ　迷你3的轉(zhuǎn)移裝置。一抗1:1000或1:500RT 2h或4度過夜(倒扣法)。下面是PMSF 的配制方法。我做過肝、腎、肺、腸等組織，腸的蛋白濃度低一些，但一般也會在10微升/微克左右?！?】我看了你的電泳圖和麗春紅染色膜的圖了。延長一抗的孵育時間?！?】適當降低二抗的濃度。這一點也挺重要的。一般上樣量在20－100微克左右比較好。所以，你看一下你的MARKER上的說明，你的16％膠是不是在它的范圍內(nèi)。[17]. 我做的片子看起來是白片子，仔細看的話（對著光／放白紙上）還是有目的條帶的，用的抗體都是說明書上的初始濃度，封閉是５％脫脂奶粉、室溫搖床一小時，ＴＢＳＴ　　?。保埃恚椋睿常豢梗炊冗^夜，ＴＢＳＴ　　　　１０ｍｉｎ＊３二抗室溫搖床一小時，ＴＢＳＴ　　?。保埃恚椋睿炒笪r幫分析一下原因，謝謝！答：【1】增加蛋白濃度或者上樣量。有沒有用內(nèi)參，內(nèi)參的條帶怎么樣？如果內(nèi)參條帶也很弱的話，那就很可能是上樣量的問題，增加上樣量一般就可以了?？梢韵葥u床室溫1小時，然后再4度搖床過夜。你可以洗三次，每次5分鐘?！?】增加曝光時間。離心的時間有些長了。提細胞蛋白和提組織的區(qū)別就是細胞要從培養(yǎng)瓶/板中先提取出來。我的方法和你的有些不同。認為是可以的。（2）一抗的濃度過高。建議延長封閉時間，我是5％脫脂奶粉室溫搖床上封閉4小時，奶粉一定要溶好，要完全溶解，沒有沉淀。【3】減少二抗孵育的時間，一般室溫1小時就可以了。這一點也挺重要的。一般上樣量在20－100微克左右比較好。[20]. 各位大蝦，我用辣根過氧化酶標記的二抗，一、二抗等這些步驟完成以后，用碧云天的ECL顯色，然后顯影，定影。【3】不知道你的一抗的推薦稀釋比例是多少。一抗可以用5％ 的脫脂奶粉稀釋。一抗孵育過后，可以用TBST搖床上室溫洗三次，每次5分鐘。[21]. 有幾個問題請教：制膠時，拔出梳子后，發(fā)現(xiàn)上樣空周圍的膠總是低于玻璃上沿，上樣量一直受到影響。首先濃縮膠一定要灌滿，越滿越好，一定要高出薄玻璃板，也就是說在保證叫濃縮膠不流下來的情況下，加的濃縮膠越多越好?！?】拔梳子的時候，可以把膠放到電泳液里之后再拔，也就是說在電泳液里拔梳子?！?】還有你說，進入分離膠后會彌散開來的?？赡苣愕牡鞍讞l帶是好的呢[22]. 我要檢測的目的蛋白表達低，上樣50UG后考染也只有很細微的條帶顯示。比如說大家在60mm皿中（細胞鋪滿）最少都要加多少裂解液就能裂解完全。用消化液或者細胞刮子的方法。我一瓶細胞一般都是加50毫升的裂解液，你可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)所加的裂解液的量。不知道你的上樣量是不是已經(jīng)最大了。western blot和免疫組化的抗原抗體結(jié)合原理不都是一樣的嗎？我想兩者的抗體應(yīng)該可以通用才對啊，但我最近用購買的適用于western的抗體做免疫組化一直作不出陽性結(jié)果，石蠟和冰凍切片均做過，均無陽性結(jié)果，請各位賜教啊。最后中性樹膠封片。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區(qū)間。因為如果可以，它早就寫了，賺錢的事情試劑公司當然愿意做。凝膠主要就是丙烯酰胺和N，N’亞甲雙丙烯酰胺形成聚丙烯酰胺的過程。（3）TEMED：也起加速反應(yīng)的催化劑的作用。答：【1】封閉的不好：感覺最大的可能原因就是封閉的問題，而你卻沒提封閉的問題。記住，用的奶粉溶解性一定要好，就是說要容易溶解，不要溶了一段時間，里面還有顆粒。一抗最好用5％的脫脂奶粉稀釋。【4】洗膜洗的太厲害了?！?】加入裂解液后可以加用超聲破碎細胞?！?】目的條帶淡，可以增加上樣量。如果目的條帶含量很低，則可以通過增加一抗的濃度來解決問題。如果有不同就會有深有淺。如果不是，就要考慮轉(zhuǎn)膜前的操作了。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后膠上的染色變淺，說明有些已經(jīng)轉(zhuǎn)過去了，但是轉(zhuǎn)膜的時間和強度不夠。如果轉(zhuǎn)移液過熱，可以減少轉(zhuǎn)移裝置的壽命，同時也影響轉(zhuǎn)移效果?！?】你的上樣量是20